a) Kiểm tra chỉ tiêu Vibrio
Pha mơi trường TCBS trong nước cất theo hướng dẫn, đun sơi mơi trường trong bình tam giác ở 100oC trong lị vi sĩng cho đến khi tan hoàn tồn các thành phần mơi trường.
Pha nước muối sinh lý, rồi đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút rồi để nguội.
Nhúng mẫu cá vào dịch bacteriocin T8, để ngấm trong khoảng 5 đến 7 phút. Sử dụng dịch vi khuẩn Vibrio đã được nuơi cấy bằng mơi trường TSB, trong 18 - 20 giờ, ở nhiệt độ 37oC để gây nhiễm lên mẫu cá cĩ nhúng dịch bacteriocin và mẫu cá đối chứng.
Lấy mỗi mẫu một phần thịt cá khoảng 3 g (cả thịt lẫn da), đem băm nhỏ. Tùy vào khối lượng của từng mẫu thêm vào dung dịch nước cất với thể tích thích hợp theo tỷ lệ 1:9.
Đồng nhất mẫu: Chuẩn bị mẫu xong, cho vào túi PE cĩ chứa mẫu và nước cất, đem đi đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian đồng nhất mỗi mẫu từ 90 đến 120 giây.
Pha lỗng mẫu:
Rĩt 9 ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng vào các ống nghiệm.
Hút 1 ml dịch mẫu từ các túi PE vào ống nghiệm, thu được dịch pha loãng với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.
Từ ống nghiệm 10-1, pha lỗng ra ống nghiệm cĩ nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9 ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm cĩ nồng độ pha lỗng mẫu 10-2, tiếp tục làm tương tự, ta cĩ các ống nghiệm cĩ độ pha loãng mẫu 10-3, 10-4.
Cấy trang:
Thao tác trong tủ cấy vơ trùng, mơi trường vơ trùng, các dụng cụ đã sấy tiệt trùng ở 160oC/120 phút và các thao tác vi sinh làm bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.
Đun sơi mơi trường TCBS để hịa tan hồn tồn các thành phần rồi để nguội tới nhiệt độ khoảng 40oC. Rĩt 15 – 20 ml mơi trường vào các đĩa petri vơ trùng. Để khi thạch trong đĩa nguội hoàn tồn rồi bắt đầu cấy.
Hút 100 µl dịch mẫu các nồng độ từ ống nghiệm cho vào các đĩa petri cĩ chứa thạch đã đánh dấu tương ứng. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.
Dùng que cấy trang trang đều dịch mẫu ra bề mặt thạch, sau đĩ lật úp các đĩa petri lại.
Dùng giấy báo bao gĩi kín các đĩa petri lại, đem đặt trong tủ ấm trong tư thế các đĩa petri nằm úp.
Nuơi cấy trong 24 giờ rồi đem đọc kết quả.
Kiểm tra lặp lại đối với các mẫu vi sinh 3 ngày và 6 ngày.
b) Kiểm tra chỉ tiêu Salmonella
Các bước tiến hành:
Pha mơi trường RV vào nước cất trong bình tam giác theo hướng dẫn, thêm một lượng agar vừa đủ. Đem mơi trường đi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
Pha nước muối sinh lý, rồi đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút rồi để nguội.
Nhúng mẫu cá vào dịch bacteriocinT8, để ngấm trong khoảng 5 đến 7 phút. Sử dụng dịch vi khuẩn Salmonella đã được nuơi cấy bằng mơi trường RV, trong 18 - 20 giờ, ở nhiệt độ 37oC để gây nhiễm lên mẫu cá cĩ nhúng dịch bacteriocin và mẫu cá đối chứng.
Lấy mỗi mẫu một phần thịt cá khoảng 3 g (cả thịt lẫn da), đem băm nhỏ. Tùy vào khối lượng của từng mẫu thêm vào dung dịch nước cất với thể tích thích hợp theo tỷ lệ 1:9.
Đồng nhất mẫu: Chuẩn bị mẫu xong, cho vào túi PE cĩ chứa mẫu và nước cất, đem đi đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian đồng nhất mỗi mẫu từ 90 đến 120 giây.
Tiến hành cấy trang. Lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ. Nuơi cấy trong 24 giờ rồi đem đọc kết quả.
Kiểm tra lặp lại đối với các mẫu vi sinh 3 ngày và 6 ngày.
c) Đọc kết quả bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật cịn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào cĩ khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên mơi trường chọn lọc.
Cách tiến hành:
Vi sinh vật sau khi được nuơi cấy trong 24 giờ được đem ra đếm số lượng khuẩn lạc. Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan cĩ uy tín như FDA, AOAC là 25 - 250 khuẩn lạc/đĩa.
Tính kết quả: Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo cơng thức:
Mi (CFU/ml) = Ai * Di/V
Trong đĩ Ai là số khuẩn lạc trung bình/đĩa, Di là độ pha loãng và V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).
Mật độ tế bào trung bình Mi trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
Chương III
3.1. Thu nhận dịch bacteriocin thơ từ chủng vi khuẩn lactic T8
Chủng vi khuẩn lactic T8 được nuơi cấy trong mơi trường MRS lỏng ở pH 6,2 - 6,8 và nhiệt độ 37oC trong 18 - 20 giờ. Dịch nuơi cấy được ly tâm ở 4oC với tốc độ 7000 vịng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi và loại bỏ cặn. Sau đĩ dịch nổi được điều chỉnh pH đến 7 bằng NaOH 1N. Cuối cùng, dịch này được sử dụng trực tiếp cho các thử nghiệm bảo quản cá giị nguyên liệu tươi. Hiệu suất của qui trình tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng dịch nổi thu được với khối lượng dịch bacteriocin ban đầu. Sau khi ly tâm với tốc độ 7000 vịng/ phút trong 10 phút, hiệu suất thu nhận bacteriocin của chủng T8 đạt được là 80% và hoạt độ bacteriocin được xác định là 8000 (AU/ml).
Dịch bacterocin thơ này cĩ pH acid vì trong thành phần của dịch cĩ acid lactic do vi khuẩn lactic tiết ra trong quá trình sinh trao đổi chất. Do đĩ, trước khi sử dụng dịch bacteriocin thơ từ chủng vi khuẩn lactic T8 để làm thí nghiệm bảo quản cá giị nguyên liệu tươi phải chuẩn pH về 7.
Việc chuẩn pH của dịch bacteriocin thơ nhằm các mục đích sau đây:
Tránh hiện tượng ăn mịn của acid làm mất màu bề mặt của da cá, ảnh hưởng xấu đến giá trị cảm quan.
Thay đổi thành phần hĩa học của cá