Protein dạng bột rắn được xác định nhóm chức bằng đo phổ hồng ngoại. Phổ hồng ngoại của bột protein được ghi trong vùng có số sóng từ 4000 – 400 cm-1. Kết quả thu được trong hình 3.6 cho thấy tần số dải amit I của protein cấu tạo bậc 2 trong phổ hồng ngoại ở 1640 – 1658 cm-1 đặc trưng cho cấu trúc xoắn α [7]. Do đó, đỉnh hấp thụ mạnh ở 1643 cm- 1 đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm C=O amit I xác định cấu trúc protein là cấu trúc xoắn α. Amit II cho một đỉnh hấp thụ ở 1539 cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng N-H. Trong vùng amit III, đỉnh hấp thụ ở 1269 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị C-N và dao động biến dạng N-H. Kết quả phổ hồng ngoại của protein tách chiết từ hạt Chùm ngây phù hợp với kết quả trong các nghiên cứu trước [30].
Như vậy, phổ hồng ngoại đã xác định được cấu tạo bậc 2 của protein tách chiết từ hạt cây Chùm ngây chủ yếu là cấu trúc xoắn α.
3.2.3. Phân tích định lượng protein bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Hàm lượng 18 axit amin trong protein tách chiết từ hạt Chùm ngây được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Quy trình phân tích axit amin Tryptophan được thực hiện sau khimẫu cân tiến hànhthủy phân bằng NaOH 4N trong 20 giờ ở 110˚C. Để
34
nguội, trung hòa đến pH 7 bằng HCl. Định mức, lọc và pha lỗng thích hợp trước khi phân tích. Đo ở thiết bị: UPLC-Acquity, cột Xbridge 4,6x150 mm, 5um, pha động với chếđộ đẳng dịng sử dụng hệ dung mơi H2O: ACN (95:5), detector huỳnh quang FLD (bước sóng kích thích ex = 295 nm; và bước sóng phát xạ em = 345nm)
Quy trình phân tích 17 axit amin cịn lại như sau:Cân khoảng 0,1 – 0,5g mẫu cho vào lọ thủy phân. Thêm 1,5 mL HCl 6N, rung siêu âm cho tan mẫu. Thổi khí N2 để đuổi hết oxy, nhanh tay đậy chặt nắp bình. Thủy phân trong tủ sấy ở 125˚C trong 24 giờ. Lấy ra, để nguội, chuyển vào bình định mức 50 mL. Thêm dung dịch NaOH để chuyển về mơi trường trung tính. Lọc qua giấy lọc.Pha loãng và và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA ở bước sóng 260 nm.
Dùng pipet tự động, hút 100 µl dung dịch mẫu ở trên vào vial. Thêm 70 µl dung dịch đệm, lắc. Thêm 30 µl dẫn xuất, lắc vortex 10 giây. Rung siêu âm ở 55˚C khoảng 8 phút và tiêm vào HPLC.
Điều kiện phân tích là:
- Thiết bị HPLC với detector PDA
- Cột tách RP18 AccQ Tag (150mm x 4,6mm x 3,9m) (Waters) - Nhiệt độ buồng cột 37˚C
- Tốc độ dòng 1 ml/phút - Thể tích bơm mẫu 10 µl
- Detector PDA với bước sóng = 260 nm
- Thành phần pha động theo chương trình rửa giải gradient với kênh A: đệm Acetat- phosphat pH = 5,05; kênh B: Acetonitril.
Kết quả phân tích thu được trong bảng 3.1. Sắc đồ được thể hiện trong phụ lục 1 đến 4.
35
Bảng 3.1. Thành phần 18 axit amin trong bột protein tách chiết từ hạt Chùm ngây
STT Axit Amin TB (mg/g) SD (mg/g) 1 Histidine 6,98 2,30.10-1 2 Serine 6,74 7,85.10-1 3 Glycine 11,35 1,88 5 Arginine 44,08 3,84 4 Aspartic 6,81 2,13 6 Glutamic 50,02 6,16 7 Threonine 5,57 7,02.10-1 8 Alanine 8,78 1,17 9 Proline 15,49 1,18 10 Cystine 3,80 4,16.10-1 11 Lysine 3,25 9,92.10-1 12 Tyrosine 5,71 2,88.10-2 13 Methionine 5,16 9,34.10-2 14 Valine 9,25 6,57.10-1 15 Isoleucine 9,14 1,05 16 Leucine 14,86 1,28 17 Phenylalanine 14,01 3,50.10-1 18 Tryptophan 3,58 2,69.10-1 Tổng (g/100g) 22,49
36
3.3. Phương pháp phân tích xác định nồng độ L-Trp và nồng độ protein
3.3.1. Phân tích L-Trp và protein bằng phương pháp UV-Vis
Tiến hành quét phổ UV-Vis của L-Trp và protein từ 240 đến 380 nm, sử dụng cuvet thạch anh bề dày 1cm và thời gian quét phổ là 3s để xác định cực đại hấp thụ.
Phổ UV-Vis của L-Trp và protein Chùm ngây với nồng độ lần lượt tại nồng độ 20ppm và 100 ppm thu được trong hình 3.7 và hình 3.8.