L ỜI CẢM ƠN
1.5. Một số nghiên cứu về bệnh trên ấu trùng tôm hùm
Phần lớn những nghiên cứu về bệnh trên đối tượng ấu trùng nhóm Crustacean đều riêng lẻ và chủ yếu là nhận dạng các tổ chức gây bệnh như Vibrio sp. [14], [21], [22], [23], [36], [37], [38], [42], [43], [48], [50]. Những nghiên cứu trước đây thường đặt ra câu hỏi bệnh trên ấu trùng, con giống tôm hùm có phải do
Vibrio spp. là tác nhân gây bệnh chủ yếu hay là hệ thống miễn dịch của cơ thể ấu trùng yếu làm các ổ bệnh có cơ hội phát triển nhanh chóng, các bệnh khác, hoặc tác
19
động của các yếu tố môi trường bất lợi ? [48], [49], [52], [53], [56]. Một số loại vi khuẩn gây bệnh cho ấu trùng tôm hùm đã được phát hiện như V. alginolyticus, V. anguillarum, V. harveyi, và V. tubiashii [14], [22]. Ngoài ra, có một số vi khuẩn dạng sợi gây bệnh cho các loài thủy sản trong đó có ấu trùng và tôm con tôm hùm đá.
Bourne và CTV đã nhận dạng được Thiothrix trên ấu trùng Phyllosoma giai đoạn đầu loài P. ornatus khi sử dụng thuật phân tích chuỗi gen (DGGE) [9]. Diggles và CTV [14] và Handlinger và CTV [22] công bố rằng vi khuẩn giống
Leucothrix là nguyên nhân gây bệnh trên loài tôm hùm Jasus sp., trong khi Jonhson và CTV [31] mô tả sự phá hoại của Leucothrix mucor trên bề mặt ấu trùng loài
Hormarus americanus.
Bourne và CTV đã thử nghiệm nuôi ấu trùng P. ornatus với các loại vi khuẩn khác nhau. Kết quả là một số vi khuẩn có ảnh hưởng đến ấu trùng Phyllosoma bao gồm Alteromonas sp., Desulfobulbus mediterraneus, Pirulella sp.,
Pseudoalteromonas sp., và Vibrio sp. Vibrios là tổ chức chiếm ưu thế và cùng với loài Vibrio parahaemolyticus trở thành những loài chiếm ưu thế trong cộng đồng vi khuẩn. Hơn thế nữa, sự gia tăng nhanh chóng số lượng vi khuẩn Vibrio spp. trong tổ chức gan tụy và bên trong cơ thểấu trùng làm giảm tỷ lệ sống của ấu trùng [9].
Nicole và CTV (2006) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm vi khuẩn Vibrionaceae trên ấu trùng tôm hùm bông. Nhóm tác giả đã xác định lượng vi khuẩn nói chung cũng như mối quan hệ giữa số lượng tế bào thuộc nhóm vi khuẩn Vibrionaceae nói riêng qua các giai đoạn phát triển của ấu trùng loài này. Khi quan sát ấu trùng từ ngày nuôi thứ 7 thấy một số lượng lớn vi khuẩn trên bề mặt ấu trùng nhưng không quan sát thấy trong tổ chức gan tụy. Tuy nhiên, đến ngày thứ 10, đã có một số lượng lớn vi khuẩn xuất hiện trong tổ chức gan tụy. Khi ấu trùng đạt 18 ngày tuổi, số lượng vi khuẩn trên bề mặt tăng gấp 5 lần và tăng gấp 10 lần trong tổ chức gan tụy. Xét riêng nhóm vi khuẩn Vibrionaceae, chúng cũng xuất hiện với số lượng lớn tế bào trên bề mặt của ấu trùng từ ngày thứ 10 và tăng lên gấp 15 lần tại ngày nuôi thứ 18 so với lúc mới nở. Đến ngày thứ 18 chúng mới xuất hiện trong tổ chức gan tụy nhưng số lượng thuộc nhóm vi khuẩn này tăng gấp 60 lần so với lúc mới nở [44].
20
Để hiểu thêm về các loại vi khuẩn cũng như quản lý ảnh hưởng của chúng đến ấu trùng tôm hùm nhằm gia tăng tỷ lệ sống cho ấu trùng, Matthew và CTV (2006) đã nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn xuất hiện trong giai đoạn đầu ấu trùng Phyllosoma loài P. ornatus. Nhóm tác giả sử dụng kính hiển vi điện tử và kỹ thuật phân tích phân tử để xác định những nhóm vi khuẩn gây bệnh có trong quá trình nuôi. Kính hiển vi điện tử có gắn máy scan sử dụng để xác định mật độ của các loại vi khuẩn. Ấu trùng được nuôi từ giai đoạn I đến giai đoạn II. Tại ngày thứ 10, từ những mẫu ấu trùng Phyllosoma chết, nhóm tác giả đã xác định được chuỗi vi khuẩn Thiothrix chiếm ưu thế (56%). Loại vi khuẩn này cũng xuất hiện trên cơ thể ấu trùng sống nhưng số lượng ít hơn (19%). Khi nhân bản và phân lập các vi khuẩn gây bệnh, đã xác định vi khuẩn dạng sợi là nguyên nhân chính gây chết ấu trùng, đồng thời cũng nhận dạng được 2 nhóm vi khuẩn là Leucothrix sp. và Vibrio sp. trên cảấu trùng sống và ấu trùng chết. Số lượng vi khuẩn Vibrio sp. tăng mạnh vào ngày thứ 7, khi ấu trùng bắt đầu lột xác. Từ kết quả trên, nhóm tác giả kết luận, với 3 nhân tố chính là tính ăn thịt đồng loại của ấu trùng, số lượng vi khuẩn dạng sợi tăng trong quá trình lột xác kết hợp với stress do quá trình lột xác đã làm giảm tỷ lệ sống của ấu trùng [40].
21
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Ấu trùng Phyllosoma của loài tôm hùm bông
Panulirus ornatus Fabricius, 1798.
Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ tháng 11/2009 đến tháng 06/2010.
Địa điểm nghiên cứu: Khu thí nghiệm của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, Nha Trang, Khánh Hòa.
Nội dung nghiên cứu: được trình bày ở Hình 2.1.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1.Dụng cụ thí nghiệm
Kính hiển vi quang học, kính hiển vi soi nổi, nhiệt kế, khúc xạ kế, máy đo pH, Test-kit: nitrite, nitrat, ammoniac và các dụng cụ khác.
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu. Thu thập và xử lý số liệu
Kết luận và đề xuất ý kiến Nội dung nghiên cứu
- Đặc điểm hình thái các giai đoạn. - Thời gian, số lần lột vỏ. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng, tỷ lệ sống
Theo dõi và phân tích mẫu bệnh trên ấu trùng Nghiên cứu một số đặc
điểm sinh học
Thử nghiệm ương nuôi ấu trùng trên 2 kiểu bể
22
2.2.2. Nguồn nước thí nghiệm
Nước biển được xử lý 5 lần qua các kiểu lọc khác nhau: lắng, lọc thô, lọc tinh, xử lý bằng tia cực tím, xử lý ozone.
Bể lắng: nước biển được bơm trực tiếp vào bể lắng. Thể tích bể: 50m3.
Thiết bị lọc thô: dùng lọc sạch nước biển, vỏ bộ lọc STBC 10 inox 304 - Việt Nam, lõi lọc WP 25P20 USA-25µm, WP 10P20 USA-10µm, WP 5P20 USA- 5µm. Máy có công suất: 3m3/giờ.
Thiết bị vi lọc (microfitrator): dùng lọc sạch nước biển, vỏ bộ lọc STBC 10 inox 304 - Việt Nam, lõi lọc WP 5P20 USA-5µm, WP 1P20 USA-1µm, WP 0,5P20 USA-0,5µm. Máy có công suất: 3m3/giờ.
Thiết bị lọc protein (Skimmer): dùng loại bỏ Protein dư thừa có kích cỡ phân tử trong bể ương nuôi ấu trùng. Vỏ bộ lọc: composite- Việt Nam, bơm lọc Ebara Italia.
Thiết bị UV (Ultraviolet): dùng xử lý nước biển bằng ánh sáng đèn tia cực tím có công suất 57L/phút. Model S12Q R-can - Canada. Máy có công suất 3m3/giờ.
Thiết bị Ozone: dùng xử lý nước biển bằng khí ozone có hàm lượng 6,5g/hr. Model: VMUS-04E-AZCO - Canada.
2.2.3. Nguồn tôm bố mẹ
Con giống tôm hùm bông khai thác tự nhiên có khối lượng trung bình 0,30 ± Hình 2.2. Máy Ozone và đèn cực tím.
23
0,12 g/con với chiều dài giáp đầu ngực khoảng 7,5 ± 0,28mm được chọn lọc đưa vào nuôi trong các lồng lưới trên biển (điều kiện môi trường nuôi: nhiệt độ nước giao động khoảng 26,9-29,0oC; độ mặn: 33,3-34ppt; oxy hòa tan; 5,3-6,7 mg/L; pH: 8; độ trong: 2,1-3,1m; tốc độ dòng chảy 13,3 cm/s và cường độ ánh sáng đạt 16,7lux) và được cho ăn bằng thức ăn cá tạp. Sau khoảng 22-24 tháng nuôi, tôm đạt kích thước thành thục sinh dục có khối lượng và 850-1000 g/con đối với tôm cái. Tôm cái mang phôi (trứng đã thụ tinh) được đưa về trại thí nghiệm để nuôi trong các bể nước chảy tuần hoàn, được tắm Formalin 40% với nồng độ 50 ppm trong thời gian 10 phút định kỳ 2 lần/tuần.
Điều kiện môi trường trong hệ thống bể nuôi tôm bố mẹ thuận lợi tối ưu cho quá trình sinh sản như: nhiệt độ nước giao động từ 27,0-31,5oC; độ mặn: 33ppt; oxy hòa tan: 6,8-7,2 mg/L; NO2: 0,02-0,03 mg/L; NH3: 0,0-0,1 mg/L. Thức ăn, liều lượng, số lần cho ăn hàng ngày của tôm hùm bố mẹ tương tự như thức ăn sử dụng khi nuôi chúng trong lồng.
Khi kiểm tra tôm mẹ thấy buồng trứng chuyển giai đoạn IV thì tắm cho tôm mẹ bằng Formol với liều lượng 50ppm trong 10 phút để loại bỏ mầm bệnh rồi chuyển tôm mẹ sang bể cho đẻ. Nước cho tôm mẹ phải đảm bảo các yêu cầu như: độ mặn (33-35ppt); nhiệt độ (26-28oC); pH (7,5-8,5), và phải được xử lý qua đèn cực tím, máy ozone và bổ sung 10ppm EDTA.
2.2.4. Nguồn ấu trùng
Tôm mẹ ấp trứng khoảng 27-30 ngày ở nhiệt độ nước khoảng 27oC, trứng nở ra ấu trùng phyllosoma. Những ấu trùng 1 ngày tuổi bơi nhanh nhẹn trên mặt nước của bể nở được thu gom bằng lưới đưa vào ương trong hệ thống bể upwellings và raceways có thể tích 1500 L/bể với mật độ 30 con/L.
Tại bể ương, nước biển đã xử lý kỹ được bổ sung 5ppm EDTA, sục khí vừa phải. Thức ăn của ấu trùng gồm các loại tảo tươi Isochrysis sp., Nanochloropsissp. với mật độ tảo cho ăn khoảng 1-1,5x105 tế bào/mL. Nauplius của Artemia với mật độ 3-5 cá thể/mL. Thời gian cấp tảo và nauplius của Artemia vào bể cách nhau 3-4 giờ.
Nước trong các bể ương ấu trùng được chảy tuần hoàn và được thay khoảng 30% định kỳ 5 ngày/lần. Nhiệt độ nước được giữ ổn định khoảng 27oC bằng máy điều hòa nhiệt độ. Các yếu tố môi trường liên quan khác như cường độ ánh sáng, độ
24
mặn, pH, oxy hòa tan, NO2, PO4 được đo định kỳ 1 tuần/lần hoặc đo bất kỳ khi cần thiết.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.Thí nghiệmnghiên cứu một số đặc điểm sinh học
2.3.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Bể thí nghiệm có thể tích 5m3 (2 bể).
Mật độ ấu trùng ban đầu là 30 con/L.
Chế độ chăm sóc được duy trì như nhau ở tất cả các bể.
Thức ăn của ấu trùng là nauplius 1 ngày tuổi của Artemia với mật độ 5 cá thể/mL.
Bổ sung tảo đơn bào 1 ngày/lần với mật độ 102-105 tế bào/L làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng và để ổn định môi trường.
Theo dõi và thu mẫu ấu trùng hàng ngày để quan sát đặc điểm hình thái của ấu trùng qua kính hiển vi.
2.3.1.2. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng
và tỷ lệ sống của ấu trùng Phyllosoma
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm độ mặn. Xác định được độ mặn phù hợp
Nước đã xử lý Ấu trùng đủ điều kiện thí nghiệm
Thí nghiệm độ mặn
Xác định tỷ lệ sống, đo tốc độ tăng trưởng. Xử lý số liệu
25
Bình thí nghiệm có thể tích 10L.
Các bình thí nghiệm được đặt trong bể nước có thể tích 2m3 để đảm bảo ổn định các yếu tố môi trường.
Mật độ ấu trùng ban đầu là 30 con/L.
Thức ăn của ấu trùng là nauplius 1 ngày tuổi của Artemia với mật độ 5 cá thể/mL Bổ sung tảo đơn bào 1 ngày/lần với mật độ 102-105 tế
bào/L làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng và để ổn định môi trường được.
Điều kiện môi trường khác và chế độ chăm sóc được duy trì như nhau ở tất cả các nghiệm thức.
Định kỳ kiểm hàng ngày sức khỏe ấu trùng và các điều kiện môi trường.
Đo kích thước ấu trùng và xác định tỷ lệ sống lúc bắt đầu và kết thúc các giai đoạn biến thái.
2.3.2. Theo dõi bệnh của ấu trùng trong thờigian thí nghiệm
Định kỳ 2 ngày lấy mẫu ấu trùng để kiểm tra trên kính hiển vi bằng phương pháp soi tươi như sau: đặt ấu trùng lên lam kính, nhỏ một giọt nước biển hoặc nước muối sinh lý, sau đó đậy lamel và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại từ nhỏ đến lớn (4X; 10X và 40X).
Quan sát sinh vật bám trên cơ thể ấu trùng như ký sinh trùng (nhóm trùng loa kèn, giun) hoặc nấm ký sinh.
Định kỳ 7 ngày lấy mẫu ấu trùng để gửi đến Phòng Bệnh của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III xét nghiệm.
Hình 2.4. Hệ thống và cách bố trí thí nghiệm độ mặn.
26
2.3.3. Thử nghiệm ương nuôi ấu trùng trong 2 kiểu bể Raceways
và Up-welling.
2.3.3.1. Cấu tạo và nguyên lý vận hành kiểu bể Up-welling
Kiểu bể Up-welling: Dạng hình Elip (độ dẹt e ≈ 0,80), kích thước bể (dài: 75cm; rộng: 50cm; cao: 15cm), để cách mặt đất 15cm và được sơn màu tối bên trong bể để tránh ánh sáng mạnh. Đáy bể bố trí 2 cụm van cấp nước tại tiêu điểm của bể sao cho dòng chảy xoáy tròn trôn ốc theo chiều từ dưới lên trên. Giữa đáy bể có đặt ống thoát nước (ống PVC có đường kính 4,9cm), xung quanh ống thoát nước có bọc lưới lọc tránh ấu trùng và Artemia lọt ra ngoài. Mực nước trong bể được điều chỉnh thông qua chiều cao mực nước trong ống thoát.
Nước vào Nước ra Mực nước Ống thoát nước 15cm 30cm Van Ống thoát nước 75cm 50cm Hình 2.5. Bể Up-welling.
27
2.3.3.2. Cấu tạo và nguyên lý vận hành kiểu bể Raceway
Kiểu bể Raceway: Dạng hình Elip (độ dẹt e ≈ 0,95), kích thước bể (dài: 90cm; rộng: 42cm; cao: 15cm), để cách mặt đất 15cm và được sơn màu tối bên trong bể để tránh ánh sáng mạnh. Thành bể bố trí 4 van nước để tạo dòng chảy theo phương ngang. Giữa đáy bể có đặt ống thoát nước (ống PVC có đường kính 4,9cm), xung quanh ống thoát nước có bọc lưới lọc tránh ấu trùng và Artemia lọt ra ngoài. Mực nước trong bể được điều chỉnh thông qua ống thoát nước.
Chăm sóc và quản lý
Mật độ ấu trùng ban đầu là 30 con/lít.
Thức ăn của ấu trùng là nauplius 1 ngày tuổi của Artemia với mật độ 5 cá thể/mL.
Bổ xung tảo đơn bào 3 ngày/lần với mật độ 102-105 tế bào/L làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng và để ổn định môi trường.
Ống thoát nước Van Van 42cm 90cm Hình 2.6. Bể Raceway. Hình 2.7. Hệ thống và cách bố trí bể Up-welling và Raceways.
28
Các điều kiện môi trường khác và chế độ chăm sóc được duy trì như nhau ở tất cả các nghiệm thức.
Đo kích thước ấu trùng và xác định tỷ lệ sống lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm.
2.4. Thu thập và xử lý số liệu
2.4.1. Phương pháp đo kích thước và quan sát ấu trùng Phyllosoma
Ấu trùng phyllosoma trong các bể ương được lấy mẫu hàng ngày để quan sát dưới kính hiển vi quang học trong suốt thời gian nghiên cứu để theo dõi hình thái và sự biến thái, tình trạng
no, đói và sức khỏe. Các giai đoạn biến thái của ấu trùng được phân chia theo tài liệu của Greg Smith & CTV (2009). Kích thước và hình ảnh của ấu trùng được ghi nhận dưới dưới kính hiển vi DC5-163 và phần mềm chụp ảnh MOTIC (component biological microscope with digital camera) của
Công ty National Optical & Scientific Instruments, San-Antonio, Taxas, Hoa Kỳ. Ấu trùng được đo chiều dài toàn thân, chiều dài và chiều rộng đầu, chiều dài ngực- bụng và chụp ảnh dưới thị kính 10 và độ phóng đại 4.
2.4.2. Các thông số môi trường trong hệ thống nuôi
Các yếu tố môi trường trong các hệ thống nuôi được đo đạc hàng ngày vào lúc 8 giờ và 14 giờ.
Nhiệt độ: đo bằng nhiệt kế thủy ngân, độ chính xác 1oC.
BL
CL
C
W
Hình 2.8. Các chỉ tiêu đo trên thân tôm BL: Chiều dài toàn thân, CL: Chiều dài đầu,
29
Độ mặn: đo bằng khúc xạ kế, độ chính xác 1ppt. pH: đo bằng máy đo pH (HANNA pH meter).
Hàm lượng nitrite và ammonia: xác định bằng Nitrit-Test (Aqua Nite) và Ammonium-Test (Aqua AM) sản xuất tại Thái Lan.
Hàm lượng oxy hòa tan: xác định bằng test-kit.
2.4.3. Xác định các thông số và công thức tính
Sinh trưởng tuyệt đối về chiều dài (GRL): được xác định theo công thức GRL = L2-L1
Trong đó GRL: sinh trưởng tuyệt đối về chiều dài tại thời điểm t (mm). L1: chiều dài của ấu trùng tại thời điểm t1 (mm)
L2: chiều dài của ấu trùng tại thời điểm t2 (mm).