2.5.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm DPPH (test DPPH)
2.5.1.1.Nguyên tắc
Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa sẽ làm giảm màu của 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Xác định khả năng này bằng cách đo quang ở bước sóng có hấp thu cực đại tại λ = 515 nm.
Hình 2.1. Công thức DPPH
2.5.1.2.Tiến hành
Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong methanol (MeOH).
Các mẫu thử cao cồn và cao nước được tiến hành nghiên cứu ở 7 nồng độ: 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml (các mẫu pha trong dd DMSO).
0,5 ml mẫu thử ở các nồng độ khảo sát được cho phản ứng với 0,5 ml dung dịch DPPH. Thêm MeOH vừa đủ 4 ml. Hỗn hợp sau khi pha được để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang ở bước sóng λ = 515 nm.
2.5.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test)
2.5.2.1.Nguyên tắc
Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA theo phương pháp của E.A.Makarova, 1989; Robak và cộng sự, 1988. MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100 0C trong vòng 10 - 15 phút. Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu. Phương trình phản ứng như sau:
Hình 2.2. Phương trình tạo phức màu giữa MDA và acid thiobarbituric
2.5.2.2.Cách tiến hành
Pha thuốc thử TBA 0,8 %.
Mỗi mẫu thử cao cồn và cao nước được tiến hành nghiên cứu ở 7 nồng độ: 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml (các mẫu pha trong dd DMSO).
Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat 5 mM theo tỉ lệ 1 : 10 (não : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5 0C. Lấy 0,5 ml dịch đồng thể,
thêm vào 0,1 ml các nồng độ mẫu thử và 1,4 ml đệm phosphat, ủ ở 37 0C trong 15 phút. Kết thúc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút, lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 1000C trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm.
Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chiếu.
2.5.3. Tính kết quả
Hoạt tính chống oxy hóa HTCO (%) được tính theo công thức: HTCO (%) = [(ODChứng - ODThử) / ODChứng] × 100
ODchứng: mật độ quang của dung môi DMSO
ODthử: mật độ quang của mẫu thử
2.6. Nghiên cứu in vivo
2.6.1. Gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophophamid (CY) [11], [24] 2.6.1.1.Nguyên tắc 2.6.1.1.Nguyên tắc
Cyclophosphamid là một chất gây ức chế miễn dịch được sử dụng phổ biến trong hóa trị liệu ung thư trên lâm sàng và là một chất gây độc ức chế các chỉ tiêu liên quan đến chức năng miễn dịch trong các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật. Ngoài ra, cyclophosphamid còn thể hiện tác dụng phụ trên các cơ quan khác như gan, thận, tiêu hóa, tiết niệu,...Gan được xem là hàng rào chắn của cơ thể, ngăn các sản phẩm độc hại thâm nhập vào qua đường tiêu hóa, đồng thời làm giảm độc tính và thải trừ một số chất cặn bã do chuyển hóa trong cơ thể tạo nên. Trong quá trình chuyển hóa ở gan, cyclophosphamid được biến đổi thành những chất có khả năng gây độc, làm gia tăng quá trình peroxy hóa lipid tại gan.
2.6.1.2.Cách tiến hành
Chuột thí nghiệm được chia thành hai nhóm: nhóm chuột bình thường CY(-) và nhóm bị gây suy giảm miễn dịch [CY(+), tiêm phúc mô liều duy nhất Endoxan®
hòa tan trong nước muối sinh lý với liều tương đương cyclophosphamid 150 mg/kg thể trọng]. Các lô thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.3.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm Nhóm Lô (N = 10-12) Tiêm phúc mạc CY (i.p.) Mẫu thử Uống Chứng - Nước cất CY(-) Thử - Cao Chứng 150mg/kg Cao CY(+) Thử 150mg/kg Nước cất CY: cyclophosphamid
Bảng 2.4. Liều tương đương với 5 g dược liệu/kg thể trọng cho các cao thử nghiệm Nấm Linh chi Việt Nam Linh chi đỏ sậm Vân chi vàng Vân chi nâu Cao C.nước C.Cồn C.nước C.cồn C.nước C.cồn C.nước C.cồn Liều uống
(g/kg) 0,44 0,41 0,24 0,27 0,56 0,42 0,59 0,33 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.6.2. Khảo sát trọng lượng cơ thể trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY miễn dịch bằng CY
Tiến hành cân trọng lượng cơ thể chuột trước khi tiêm CY và sau 5 ngày, 10 ngày ở cả 2 nhóm bình thường và nhóm gây suy giảm miễn dịch.
2.6.3. Khảo sát huyết học trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY bằng CY
Tiến hành lấy máu đuôi chuột sau 5 ngày và 10 ngày ở các nhóm chuột. Máu chuột được kiểm tra huyết học tại Bệnh viện Bình Dân bằng hệ thống phân tích huyết học tự động Abbott Cell-Dyn 3700.
2.6.4. Khảo sát trọng lượng tương đối của các cơ quan trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY
Sau 10 ngày, chuột ở hai nhóm bình thường và nhóm gây suy giảm miễn dịch được tách lấy gan, lách, tuyến ức, tuyến thượng thận để xác định trọng lượng tương đối của các cơ quan bằng công thức sau:
g % = Pcq /Pct * 100 Pcq: trọng lượng của cơ quan
Pct: trọng lượng cơ thể chuột tại thời điểm khảo sát
2.6.5. Khảo sát hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan sau khi gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid
Sơđồ 2.2. Khảo sát hàm lượng MDA trong gan sau khi tiêm cyclophosphamid
Định lượng hàm lượng MDA trong gan
Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1 : 10 (gan : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5 0C. Lấy 2 ml dịch đồng thể, thêm vào 1 ml dung dịch đệm Tris - HCl, ủ ở 37 0C trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10 %, ly tâm 10000 vòng/phút, lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8 % ở 100 0C trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm. [13]
2.6.6. Khảo sát tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống gốc tự do qua việc định lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan
Sau khi gây suy giảm miễn dịch và điều trị theo sơ đồ 2.3 , tiến hành định lượng hàm lượng MDA như phần 2.6.5.
Ngày 1 Cân trọng lượng Tiêm CY Định lượng MDA Định lượng MDA Định lượng MDA
Uống mẫu thử nghiệm (10 ml/kg)
Ngày 1 2 3 4 5 6 7 8
Cân trọng lượng và tiêm CY Cân trọng lượng và định lượng MDA
Sơđồ 2.3. Khảo sát tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống gốc tự do.
2.6.7. Tính kết quả
Hàm lượng MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi qui chất chuẩn MDA: y = 0,0637x - 0,0029 (R2 = 0,9981).
CnMMDA/ml dịch đồng thể = (ODthử + 0,0029)/0,0637.
Sau khi tính được hàm lượng MDA (nM/ml dịch đồng thể) ⇒ hàm lượng MDA (nM/g protid).
2.7. Đánh giá kết quả
Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình M ± SEM (Standard Error of Mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê bằng phần mềm Jandel Scientific SigmaStat-98 dựa vào phép kiểm One-Way ANOVA hay Student t-test với P < 0,05.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát thực vật
3.1.1. Khảo sát hình thái bên ngoài
Linh chi Việt Nam: Nấm Linh chi Việt Nam có tai nấm hoá gỗ; mũ xoè tròn, hình thận, có cuống ngắn. Mặt trên mũ có vân đồng tâm, màu nâu sẫm. Mặt dưới phẳng, nâu nhạt hơn mặt trên, có nhiều lỗ li ti.
Hình 3.1. Quả thể nấm Linh chi Việt Nam cắt dọc
Linh chi đỏ sậm: Nấm Linh chi đỏ sậm có tai nấm hoá gỗ; mũ xoè tròn, hình thận, có cuống ngắn. Mặt trên mũ có vân đồng tâm và được phủ bởi lớp sắc tố bóng láng như verni, màu đỏ sậm. Mặt dưới phẳng, màu trắng hoặc vàng; có nhiều lỗ li ti. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2. Mặt trên quả thể nấm Linh chi đỏ sậm
Hình 3.3. Mặt dưới quả thể nấm Linh chi đỏ sậm
Vân chi vàng: Mũ nấm không có cuống, dai. Mặt trên có vân đồng tâm, có lông mịn, mặt dưới có lỗ nhỏ li ti, có màu vàng đất. Mép mỏng.
Hình 3.4. Quả thể nấm Vân chi vàng Hình 3.5. Mặt dưới quả thể nấm Vân chi vàng
Vân chi nâu: Mũ nấm không có cuống, dai. Mặt trên có vân đồng tâm, có lông mịn, mặt dưới có lỗ nhỏ li ti, có màu nâu vàng. Mép mỏng, uốn sóng.
Hình 3.6. Quả thể của nấm Vân chi nâu
3.1.2. Khảo sát vi học
3.1.2.1.Khảo sát bột dược liệu
¾ Linh chi Việt Nam:
Cảm quan: bột tơi xốp, màu nâu
Soi bột: Bào tử đảm có hình bầu dục dài 7,5 - 10 µm, rộng 5 - 7,5 µm, có màng trong suốt bao bên ngoài. Hệ sợi dài, có phân nhánh.
Hình 3.7. Bào tử của nấm Linh chi Việt Nam Hình 3.8. Hệ sợi của Linh chi Việt Nam ¾ Linh chi đỏ sậm:
Cảm quan: bột tơi xốp, màu nâu sậm
Soi bột: Bào tử có hình bầu dục dài khoảng 10 µm, rộng khoảng 7,5 µm. Hệ
sợi không phân nhánh.
Hình 3.9. Bào tử và hệ sợi của Linh chi đỏ sậm ¾ Vân chi vàng:
Cảm quan: bột tơi có sợi, màu vàng nhạt
Soi bột : Không tìm thấy bào tử. Hệ sợi phân nhánh
Bào tử
Hệ sợi Bào tử
Hình 3.10. Hệ sợi của Vân chi vàng Hình 3.11. Hệ sợi Vân chi nâu ¾ Vân chi nâu:
Cảm quan: bột tơi có sợi, màu xám trắng
Soi bột: Không tìm thấy bào tử. Hệ sợi không phân nhánh.
3.1.2.2. Khảo sát vi phẫu
¾ Linh chi Việt Nam: Cắt ngang quả thể khô: quan sát thấy nhiều lỗ, đó là buồng chứa bào tử có hình ngũ giác đều, kích thước 0,15 mm, bào tử đính trên thành.
¾ Linh chi đỏ sậm: Cắt ngang quả thể khô: quan sát thấy nhiều lỗ, đó là buồng chứa bào tử tròn, đường kính 0,125 mm, bào tửđính trên thành.
¾ Vân chi vàng: Cắt ngang quả thể khô: quan sát thấy nhiều lỗ hình bầu dục
đều nhau.
¾ Vân chi nâu: Cắt ngang quả thể khô: quan sát thấy nhiều lỗ hình bầu dục.
Hệ sợi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.12. Cắt ngang quả thể khô Linh chi Việt Nam (VK 40)
Hình 3.13. Cắt ngang quả thể khô Linh chi đỏ sậm (VK 40)
Hình 3.14. Cắt ngang quả thể khô Vân chi vàng (VK 40)
Hình 3.15. Cắt ngang quả thể khô Vân chi nâu (VK 40)
3.2. Thử tinh khiết 3.2.1. Độẩm 3.2.1. Độẩm Bảng 3.1. Độẩm của nguyên liệu Nấm Lần 1 (%) Lần 2 (%) Lần 3 (%) Trung bình (%)
Linh chi Việt Nam 11,29 11,46 11,86 11,54
Linh chi đỏ sậm 10,59 10,29 10,25 10,38
Vân chi vàng 9,73 9,07 - 9,57
Vân chi nâu 8,96 9,56 9,8 9,44
Nhận xét: Độ ẩm của nguyên liệu của Linh chi Việt Nam là 11,54 %, Linh chi đỏ sậm là 10,38 %, Vân chi vàng là 9,57 %, Vân chi nâu 9,44 % (< 13%) phù hợp với độẩm của đa số dược liệu. Bảng 3.2.Độẩm của cao Nấm Cao Lần 1 (%) Lần 2 (%) Lần 3 (%) Trung bình (%) Cao cồn 13,94 13,67 12,99 13,53
Linh chi Việt Nam
Cao nước 15,78 15,38 15,29 15,48 Cao cồn 16,34 16,53 16,85 16,57 Linh chi đỏ sậm Cao nước 11,57 11,31 11,15 11,34 Cao cồn 10,78 10,54 11,46 10,93 Vân chi vàng Cao nước 11,05 11,16 10,95 11,05 Cao cồn 11,16 11,63 11,48 11,42
Vân chi nâu
Cao nước 11,44 11,57 11,65 11,56
Nhận xét: Độ ẩm của các loại cao đạt quy định Dược điển Việt Nam III áp dụng cho cao đặc (< 20%).[5]
3.2.2. Độ tro
Bảng 3.3. Kết quảđộ tro nguyên liệu của các nấm dược liệu.
Tro Nấm Lần 1 (%) Lần 2 (%) Lần 3 (%) Trung bình (%)
Linh chi Việt Nam 1,69 1,61 - 1,65
Linh chi đỏ sậm 1,13 1,02 1,12 1,09
Vân chi vàng 6,61 6,85 6,73
Tro toàn phần
Vân chi nâu 7,68 7,97 7,19 7,62
Linh chi Việt Nam 0,171 0,142 - 0,157
Linh chi đỏ sậm 0,054 0,053 - 0,054
Vân chi vàng 0,492 0,543 0,518 0,519
Tro không tan trong
acid Vân chi nâu 0,604 0,579 0,567 0,583
Nhận xét:
¾ Linh chi Việt Nam và Linh chi đỏ sậm có tỉ lệ tro toàn phần đạt tiêu chuẩn theo chuyên luận về nấm Linh chi trong Dược điển Trung Quốc (tỉ lệ tro toàn phần không nhiều hơn 3,2 % và tỉ lệ tro không tan trong acid không nhiều hơn 0,5 %).[16] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
¾ Do chưa có chuyên luận về độ tro của nấm Vân chi nên các nhận định của chúng tôi chỉ ghi nhận là cao hơn so với chuyên luận về nấm Linh chi trong Dược điển Trung Quốc.
3.3.Kết quả phân tích thành phần hoá học
Bảng 3.4. Kết quảđịnh tính phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của bột dược liệu, cao cồn và cao nước của Linh chi Việt Nam.
Kết quảđịnh tính chung Nhóm hợp chất
Bột dược liệu Cao cồn Cao nước
Tinh dầu - - - Chất béo - - - Carotenoid - - - Triterpenoid tự do + + - Alkaloid - - - Coumarin - - - Anthraquinon - - - Flavonoid - - - Anthocyanosid - - - Proanthocyanosid - - - Tanin - - - Saponin + - + Acid hữu cơ + + + Chất khử - - - Polyuronic - + - Chú thích: (-) : Không có (+) : Có ít
Nhận xét: Trong nấm Linh chi Việt Nam có triterpenoid tự do, saponin, acid hữu cơ, polyuronic.
Bảng 3.5. Kết quảđịnh tính phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của bột dược liệu, cao cồn và cao nước của Linh chi đỏ sậm.
Kết quảđịnh tính chung Nhóm hợp chất
Bột dược liệu Cao cồn Cao nước
Tinh dầu - - - Chất béo - - - Carotenoid - - - Triterpenoid tự do + + + Alkaloid - ± - Coumarin - - - Antraglycosid - - - Flavonoid - - - Anthocyanosid - - - Proanthocyanosid - - - Tanin - - - Saponin ± - ± Acid hữu cơ + + + Chất khử + + + Polyuronic ++ + ++ Chú thích: (-) : Không có (±) : Nghi ngờ (+) : Có ít (+ +): Có
Nhận xét: Trong nấm Linh chi đỏ sậm có triterpenoid tự do, acid hữu cơ, chất khử, polyuronic.
Bảng 3.6. Kết quảđịnh tính phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của bột dược liệu, cao cồn và cao nước của Vân chi vàng.
Kết quảđịnh tính chung Nhóm hợp chất
Bột dược liệu Cao cồn Cao nước
Tinh dầu + - - Chất béo + + + Carotenoid - ± + Triterpenoid tự do + + + Alkaloid - - ± Coumarin - - - Antraglycosid - - - Flavonoid - - - Anthocyanosid - - - Proanthocyanosid - - - Tanin - - - Saponin ± + ± Acid hữu cơ - ++ - Chất khử ± ± + Polyuronic - - - Chú thích: (-) : Không có (±) : Nghi ngờ (+) : Có ít (+ +): Có
Nhận xét: Trong nấm Vân chi vàng có tinh dầu, chất béo, carotenoid, triterpenoid tự do, saponin, chất khử.
Bảng 3.7. Kết quảđịnh tính phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của bột dược liệu, cao cồn và cao nước của Vân chi nâu.
Kết quảđịnh tính chung Nhóm hợp chất
Bột dược liệu Cao cồn Cao nước
Tinh dầu + + + Chất béo + - - Carotenoid - - - Triterpenoid tự do ++ + + Alkaloid - ++ - Coumarin + + - Anthaquinon - + - Flavonoid - - - Anthocyanosid - - - Proanthocyanosid - - - Tanin ± ± - Saponin ± ± + Acid hữu cơ - - - Chất khử - - - Polyuronic + + + Chú thích: (-) : Không có (±) : Nghi ngờ (+) : Có ít (+ +): Có
Nhận xét: Trong nấm Vân chi vàng có tinh dầu, chất béo, triterpenoid tự do, coumarin, alkaloid, anthraquinon, saponin, polyuronic.
3.4.Kết quả nghiên cứu in vitro
3.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm DPPH DPPH
Bảng 3.8. Hoạt tính chống oxy hóa cao cồn và cao nước Linh chi Việt Nam trong thử nghiệm DPPH (OD trung bình của 3 lần đo)
Cao cồn Cao nước Nồng độ (µg/ml) OD Trung bình HTCO (%) OD Trung bình HTCO (%) 2000 0,089 89,44 0,205 75,68 1500 0,121 85,65 0,286 66,13 1000 0,203 75,95 0,362 57,12 500 0,427 49,38 0,523 37,99 100 0,729 13,55 0,741 12,10 50 0,784 6,97 0,772 8,42 10 0,811 3,77 0,821 2,67 y = 0.0579x + 8.7372 R2 = 0.9428 0 20 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 Nồng độ (μg/ml) HT CO ( % ) y = 0.0368x + 10.011 R2 = 0.9375 0 20 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 2500 Nồng độ (μg/ml) HTCO (%) Biểu đồ 3.1a. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của cao cồn Linh chi Việt Nam trong thử nghiệm DPPH.
Biểu đồ 3.1b. Hoạt tính chống oxy hóa
in vitro của cao nước Linh chi Việt Nam trong thử nghiệm DPPH.
Qua phương trình tuyến tính của hoạt tính chống oxy hóa của cao cồn và cao nước Linh chi Việt Nam trong thử nghiệm DPPH suy ra được IC50 của cao cồn Linh
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});