1.5.1. Trong nước [1], [7], [10], [11], [14]
Thăm dò hoạt tính chống oxy hóa của Linh chi Ganoderma lucidum trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp in vitro và in vivo bằng cách đo hàm lượng MDA trong não chuột. Trong nghiên cứu, tác giả sử dụng tác nhân gây stress ở chuột là nhiệt độ. Trong nghiên cứu này cho thấy Linh chi nuôi trồng ở Việt Nam có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid khi chịu stress ở nhiệt độ cao. [10]
Tác dụng bảo vệ gan chuột của nấm Linh chi Việt Nam trên chuột gây tổn thương gan thực nghiệm bằng cách thử cao nấm Linh chi trên chuột cống trắng được gây tổng thương gan bằng paracetamol hoặc carbon tetraclorid (CCl4), cao lỏng nấm Linh chi đã ngăn cản sự gia tăng AST, ALT gây bởi CCl4 và có tác dụng làm giảm cholesterol và protein toàn phần.[1]
3 loài nấm Linh chi Ganoderma lucidum, G. applanatum, G. lobatum đều có hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình gây tổn thương gan cấp bằng CCl4.[7]
Một số tính chất sinh y học của nấm Linh chi Ganoderma lucidum: đánh giá hoạt độ các enzym catalase, superoxyd dismutase, NADH oxidase của nấm
Ganoderma lucidum ở mẫu quả thể và sinh khối. Tinh sạch một phần enzym NADH oxidase của nấm Ganoderma lucidum: Nghiên cứu về độ bền nhiệt, ảnh hưởng của các ion kim loại, khả năng sinh H2O của enzym NADH oxidase từ nấm
Ganoderma lucidum.
Cao nước chiết xuất từ nấm Vân chi Việt Nam không thể hiện độc tế bào trên thử nghiệm in vitro với các dòng tế bào ung thư gan và ung thư màng tử cung.[14]
Cao cồn chiết xuất từ nấm Vân chi Việt Nam có tác dụng ức chế tế bào ung thư gan và ung thư màng tử cung trên thử nghiệm in vitro.[14]
Polysaccharid chiết xuất từ nấm Vân chi có tác dụng tăng cường miễn dịch (tăng số lượng bạch cầu, tăng bạch cầu trung tính) trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid.[14]
Polysaccharid và cao cồn của nấm Vân chi có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào u báng sarcoma 180 ở chuột gây u báng.[14]
1.5.2. Ngoài nước: [27], [29], [30], [31]
Các polysaccharid và proteoglycan trong Linh chi có tác dụng bảo vệ gan và phục hồi những tổn thương gan do stress oxy hóa gây bởi carbon tetraclorid, ethanol và BCG theo cơ chế dập tắt gốc tự do.
Dịch chiết nước nóng của Linh chi có tác dụng bảo vệ tế bào gan, tim, thận trong tổn thương oxy hóa gây bởi ethanol như: ức chế phản ứng peroxy hóa lipid, dập tắt gốc tự do superoxyd anion.
Dịch chiết nước nóng của Linh chi có tác dụng như là chất bảo vệ phóng xạ (radioprotector) và bảo vệ tế bào trước tổn thương oxy hóa DNA gây bởi phản ứng Fenton có xúc tác kim loại hoặc gây bởi bức xạ UV.
Dịch chiết methanol của Linh chi có tác dụng ức chế phản ứng peroxy hóa lipid. Dịch chiết polysaccharid của Linh chi (liều uống 50 và 200 mg/kg) có tác dụng bảo vệ tế bào não trong tổn thương thiếu máu não gây bởi stress oxy hóa theo cơ chế chống oxy hóa như: làm giảm hàm lượng MDA, ức chế sự tạo thành các gốc oxy hoạt động trong não, làm gia tăng hàm lượng enzym manganese superoxyd dismutase (Mn-SOD).
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu
Nấm Linh chi Việt Nam (LCVN), Linh chi đỏ sậm (LCĐS) (Ganoderma lucidum), Vân chi nâu (VCN), Vân chi vàng (VCV) (Trametes versicolor) được cung cấp bởi ThS. Cổ Đức Trọng, Trung tâm Nghiên cứu Linh chi và Nấm dược liệu. Dược liệu được xay nhỏ, bảo quản nơi khô mát. Các mẫu thử được chiết từ bột nấm.
Cao cồn được chuẩn bị bằng cách chiết hồi lưu Soxhlet bột nguyên liệu với cồn 96 % theo tỷ lệ 1 : 15 (dược liệu : dung môi), dịch chiết được cô giảm áp thu được cao cồn với hiệu suất chiết theo bảng 2.1. Cao nước được chuẩn bị bằng cách đun nguyên liệu 3 lần với nước nóng, mỗi lần trong 1 giờ ở 100°C theo tỷ lệ 1 : 15 (dược liệu : dung môi), dịch chiết được cô cách thủy thu được cao nước với hiệu suất chiết theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Hiệu suất chiết các cao của các nấm dược liệu Nấm dược liệu Cao Hiệu suất (%)
Cao cồn 8,2 Linh chi Việt Nam
Cao nước 4,8 Cao cồn 5,4 Linh chi đỏ sậm Cao nước 8,8 Cao cồn 6,6 Vân chi vàng Cao nước 11,8 Cao cồn 8,4 Vân chi nâu
2.1.2 Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực, Mus musculus var Albino, 5 - 6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế – TP. Nha Trang và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm.
Chuột được nuôi đầy đủ bằng thực phẩm viên, giá, rau xà lách và nước uống đầy đủ.
Thể tích cho uống hay tiêm là 10 ml/kg thể trọng chuột.
2.1.3 Hóa chất
Endoxan® 500 mg: chứa thành phần hoạt chất: 534,5 mg cyclophosphamid momohydrat tương ứng với 500 mg cyclophosphamid khan (ký hiệu CY), Baxter Oncology GmbH, Germany. Lô sản xuất 8K593E, sản xuất 11/2008, hạn dùng 11/2011.
Methanol (MeOH).
1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH). Trolox (Calbiochem Ltd. Co.).
Acid ascorbic (Merck Co. Germany).
Malonyl dialdehyd (MDA) (Merck Co. Germany) Đệm Phosphat (PBS)
Dung dịch Dimethylsulfoside (DMSO) (Merck ) Kali clorid 1,15% (KCl).
Natri clorid 0,9% (NaCl).
Đệm Tris-HCl (Merck Co. Germany). Acid tricloacetic (TCA).
Acid thiobarbituric (TBA) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Các dung môi và thuốc thử thông thường khác
2.1.4 Máy móc-Thiết bị
Tủ sấy Memmert (Germany).
Cân kĩ thuật Mettler Toledo AB204. Máy cô giảm áp Buchi waterbath B-480. Máy siêu âm Bransonic ultrasonic cleaner. Đèn soi UV Desaga.
Máy đo pH Meter Schott.
Thiết bị nghiền đồng thể (KA Works, Asia Sdn. Bhđ, Malaysia). Máy ổn nhiệt hiệu Desconectar.
Máy ly tâm lạnh Sartorius (Germany).
Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến Unicam, HE λ 10 SY vision 32 Software, thermo Spectrorius.
Máy phân tích huyết học tự động Abbott Cell-Dyn 3700
2.2. Khảo sát thực vật
2.2.1. Khảo sát hình thái bên ngoài
Quan sát dược liệu bằng mắt thường, mô tả đặc điểm hình thái quả thể: hình dạng, màu sắc, kích thước, mặt trên, mặt dưới.
2.2.2. Khảo sát vi học
2.2.2.1.Khảo sát bột dược liệu
Quan sát bột bằng cảm quan.
Soi bột: dược liệu được cắt nhỏ, sấy ở nhiệt độ khoảng 60 0C, tán nhỏ, nghiền nát, soi trong dung dịch KOH bằng kính hiển vi, chụp hình.
2.2.2.2.Khảo sát vi phẫu
Tiến hành cắt vi phẫu, soi dưới kính hiển vi và chụp hình
2.3. Thử tinh khiết [3]
2.3.1. Xác định độ mất khối lượng do làm khô
Đĩa nhôm đựng mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi ở 105 °C. Cân chính xác 2 g bột dược liệu trên đĩa, đem sấy ở 105 °C khoảng 8 giờ đến khối lượng không đổi. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm khoảng 15 phút. Cân và ghi lại kết quả. Tiếp tục sấy và cân lại như trên vài lần đến khi nào kết quả hai lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 0,5 mg.
Thực hiện trên 3 mẫu và lấy giá trị trung bình. Công thức xác định độ ẩm :
X: tỉ lệ độ ẩm dược liệu (%)
a: khối lượng bột dược liệu hay khối lượng cao trước lúc sấy
b: khối lượng bột dược liệu hay khối lượng cao sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi
2.3.2. Độ tro
2.3.2.1.Tro toàn phần
Tro toàn phần là lượng tro còn lại sau khi nung một dược liệu. Các ion trong tro toàn phần ở dưới dạng carbonat hay oxid.
Cách tiến hành:
Cân chính xác 1 g nguyên liệu cho vào chén nung đã nung đến khối lượng không đổi. Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
X =
a - b
Đặt chén vào lò nung ở 300 - 600 °C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi kết quả. Đặt chén tro vào lò nung tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ và đem ra cân. Tiếp tục làm như vật cho đến khi nào kết quả hai lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 0,5 mg.
Tính kết quả :
G: Trọng lượng chén nung (g)
G1: Trọng lượng chén nung và mẫu thử (g)
G2: Trọng lượng chén và tro trắng sau khi đã nung và cân đến trọng lượng không đổi (g)
X : Tỉ lệ độ ẩm dược liệu (%)
2.3.2.2.Tro không tan trong acid
Cách tiến hành
Hòa tan tro toàn phần ở trên vào 25 ml HCl 4N, đun cách thủy trong 10 - 15 phút. Thành phần tro không tan được lọc trên giấy lọc không tro. Rửa cả lọc và tro bằng nước cất nóng đến khi dịch lọc cho phản ứng trung tính (thử bằng giấy quỳ).
Sau đó đem giấy lọc chứa chất không tan trong HCl cho vào chén nung để nung trên bếp điện đến khi thấy không còn khói trắng bay lên. Tiếp tục đưa vào lò nung và thực hiện như cách tiến hành của tro toàn phần.
Tính kết quả: Tro không tan trong acid (%) = ( 2 − 1)×100
m m m
m1 : Khối lượng chén nung (g)
m2 : Khối lượng chén nung và tro không tan trong HCl (g) m : Khối lượng mẫu thử (g)
Tro toàn phần (%) = G2 - G
2.4. Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật [3] 2.4.1. Nguyên tắc
Quy trình dùng để xác định nhanh một số nhóm hợp chất thường gặp trong nguyên liệu thực vật bằng các phản ứng hóa học (thường được gọi là phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật) dựa trên nguyên tắc: phân tách hỗn hợp các chất trong nguyên liệu thành 3 phân đoạn đơn giản dựa theo độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt qua các dung môi: ether ethylic, ethanol, và nước, dùng các phản ứng hóa học đặc trưng (thường là các phản ứng kết tủa, phản ứng màu) để phát hiện các nhóm hợp chất có trong dịch chiết.
Tiến hành phân tích theo quy trình phân tích thành phần hóa thực vật của Bộ môn Dược liệu – Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược TP.HCM dựa trên cơ sở quy trình phân tích của Ciuley (Trường Đại học Dược khoa Rumani) có sửa đổi.
2.4.2. Chiết xuất
Cân khoảng 10 g dược liệu và chiết lần lượt qua các dung môi ether ethylic, ethanol 96 %, nước cất, lượng dịch chiết của mỗi loại cô còn khoảng 50 ml để định tính.
Sơđồ 2.1. Tóm tắt quy trình chiết xuất trong phân tích thành phần hóa thực vật 2.4.3. Định tính bằng phản ứng hoá học Bã dược liệu Dịch chiết ether Bã dược liệu Dịch chiết cồn
Ether ethylic/ soxhlet
Ethanol hồi lưu
Bã dược liệu Dịch chiết nước
Nước/ cách thủy Dược liệu
Bảng 2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật Dược liệu Chiết bằng ether Bã dược liệu Chiết bằng cồn Chiết bằng Dịch nước Bã dược liệu Dịch ether Dịch cồn Carotenoid Phản ứng Carr-Price Tritepenoid tự do Phản ứng Liebermann-Burchard Coumarin Phát huỳnh quang/ OH-
Alkaloid Thuốc thử chung
Anthraquinon Phản ứng Bornträger
Flavonoid Phản ứng Cyanidin
Alkaloid Thuốc thử chung
Coumarin Phát huỳnh quang/ OH-
Glycosid tim Thuốc thử Raymond-Marthoud, xanthydrol
Flavonoid γ–pyron Phản ứng Cyanidin
Anthocyanidin HCl đđ
Proanthocyanidin HCl/t0 Æ tủa đỏ
Tannin FeCl3 5%, gelatin muối
Saponin Phản ứng Liebermann-Burchard và tính tạo bọt trong nước
Acid hữu cơ Na2CO3Æ sủi bọt
Hợp chất khử Thuốc thử Fehling
Alkaloid Thuốc thử chung
Glycosid tim Thuốc thử Raymond-Marthoud, xanthydrol
Flavonoid γ–pyron Phản ứng Cyanidin
Anthocyanidin HCl đđ
Proanthocyanidin HCl/t0 Æ tủa đỏ
Tannin FeCl3 5%, gelatin muối
Saponin Phản ứng Liebermann-Burchard và tính tạo bọt trong nước
Acid hữu cơ Na2CO3 Æ sủi bọt
Hợp chất khử Thuốc thử Fehling
Polyuronic Pha loãng trong cồn Æ tủa
NO2
NO2 N NO2
N
2.5. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro [13]
2.5.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm DPPH (test DPPH)
2.5.1.1.Nguyên tắc
Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa sẽ làm giảm màu của 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Xác định khả năng này bằng cách đo quang ở bước sóng có hấp thu cực đại tại λ = 515 nm.
Hình 2.1. Công thức DPPH
2.5.1.2.Tiến hành
Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong methanol (MeOH).
Các mẫu thử cao cồn và cao nước được tiến hành nghiên cứu ở 7 nồng độ: 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml (các mẫu pha trong dd DMSO).
0,5 ml mẫu thử ở các nồng độ khảo sát được cho phản ứng với 0,5 ml dung dịch DPPH. Thêm MeOH vừa đủ 4 ml. Hỗn hợp sau khi pha được để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang ở bước sóng λ = 515 nm.
2.5.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test)
2.5.2.1.Nguyên tắc
Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA theo phương pháp của E.A.Makarova, 1989; Robak và cộng sự, 1988. MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100 0C trong vòng 10 - 15 phút. Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu. Phương trình phản ứng như sau:
Hình 2.2. Phương trình tạo phức màu giữa MDA và acid thiobarbituric
2.5.2.2.Cách tiến hành
Pha thuốc thử TBA 0,8 %.
Mỗi mẫu thử cao cồn và cao nước được tiến hành nghiên cứu ở 7 nồng độ: 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml (các mẫu pha trong dd DMSO).
Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat 5 mM theo tỉ lệ 1 : 10 (não : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5 0C. Lấy 0,5 ml dịch đồng thể,
thêm vào 0,1 ml các nồng độ mẫu thử và 1,4 ml đệm phosphat, ủ ở 37 0C trong 15 phút. Kết thúc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút, lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 1000C trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm.
Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chiếu.
2.5.3. Tính kết quả
Hoạt tính chống oxy hóa HTCO (%) được tính theo công thức: HTCO (%) = [(ODChứng - ODThử) / ODChứng] × 100
ODchứng: mật độ quang của dung môi DMSO
ODthử: mật độ quang của mẫu thử
2.6. Nghiên cứu in vivo
2.6.1. Gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophophamid (CY) [11], [24] 2.6.1.1.Nguyên tắc 2.6.1.1.Nguyên tắc
Cyclophosphamid là một chất gây ức chế miễn dịch được sử dụng phổ biến trong hóa trị liệu ung thư trên lâm sàng và là một chất gây độc ức chế các chỉ tiêu liên quan đến chức năng miễn dịch trong các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật. Ngoài ra, cyclophosphamid còn thể hiện tác dụng phụ trên các cơ quan khác như gan, thận, tiêu hóa, tiết niệu,...Gan được xem là hàng rào chắn của cơ thể, ngăn các sản phẩm độc hại thâm nhập vào qua đường tiêu hóa, đồng thời làm giảm độc tính và thải trừ một số chất cặn bã do chuyển hóa trong cơ thể tạo nên. Trong quá trình chuyển hóa ở gan, cyclophosphamid được biến đổi thành những chất có khả năng gây độc, làm gia tăng quá trình peroxy hóa lipid tại gan.
2.6.1.2.Cách tiến hành
Chuột thí nghiệm được chia thành hai nhóm: nhóm chuột bình thường CY(-) và nhóm bị gây suy giảm miễn dịch [CY(+), tiêm phúc mô liều duy nhất Endoxan®
hòa tan trong nước muối sinh lý với liều tương đương cyclophosphamid 150 mg/kg thể trọng]. Các lô thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.3.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm Nhóm Lô (N = 10-12) Tiêm phúc mạc CY (i.p.) Mẫu thử Uống Chứng - Nước cất CY(-) Thử - Cao Chứng 150mg/kg Cao CY(+) Thử 150mg/kg Nước cất CY: cyclophosphamid
Bảng 2.4. Liều tương đương với 5 g dược liệu/kg thể trọng cho các cao thử nghiệm Nấm Linh chi Việt Nam Linh chi đỏ sậm Vân chi vàng Vân chi nâu Cao C.nước C.Cồn C.nước C.cồn C.nước C.cồn C.nước C.cồn Liều uống
(g/kg) 0,44 0,41 0,24 0,27 0,56 0,42 0,59 0,33
2.6.2. Khảo sát trọng lượng cơ thể trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY miễn dịch bằng CY
Tiến hành cân trọng lượng cơ thể chuột trước khi tiêm CY và sau 5 ngày, 10 ngày ở cả 2 nhóm bình thường và nhóm gây suy giảm miễn dịch.
2.6.3. Khảo sát huyết học trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY bằng CY
Tiến hành lấy máu đuôi chuột sau 5 ngày và 10 ngày ở các nhóm chuột. Máu chuột được kiểm tra huyết học tại Bệnh viện Bình Dân bằng hệ thống phân tích