2. 1 Tình hìn hô nhiễm dầu trên thế giới:
3.2.7. Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật dựa vào xác định trình tự đoạn
trên mã hóa 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại:
* Tách chiết DNA tổng số
Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số [44].
Nguyên tắc:
DNA tổng số đƣợc tách chiết theo các bƣớc cơ bản sau: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân loại bỏ protein tủa DNA. Để thu đƣợc DNA sạch ta cần loại bỏ các thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protrein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleicacid/proteins) trong hai pha không hòa tan ( phenol, chloroform/nƣớc
). Tiến hành tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào ( DNase và Rnase ).
Tiến hành:
- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào eppendorf 1,5 ml,ly tâm 7.000 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ dịch,thu sinh khối,rửa 2 lần bằng đệm natri phosphate (pH 8).
- Bổ sung 540 l, extration buffer, vortex kỹ.
- Bổ sung 20µl protease K (20 mg/ml, lắc ở 370C trong vòng 30 phút. - Bổ sung 60 µl SDS (sodium Doecyl Sufate) 20% rồi ủ ở 65oC trong 2h hoặc lắc qua đêm.
- Bổ sung 600 µl Cl (Chlororm : Isoamylalchohol = 24:1), ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút. Hút pha trên,lặp lại 1-2 lần tuỳ thuộc vào mẫu bẩn hay mẫu sạch.
- Kết tủa DNA bằng isopanol bằng 6 lần thể tích dịch pha trên,ủ ở nhiệt độ phòng từ 1 - 2giờ.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 0C, thu DNA.
- Rửa tủa bằng 500 µl ethanol lạnh 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0C rồi bỏ dịch .
- Để khô tự nhiênvà hoà tan tủa trong 25 - 30 µl nƣớc khử ion vô trùng. * Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR:
Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [35]. Phƣơng pháp này đã tạo ra bƣớc nhảy vọt trong kỹ thuật sinh học phân tử và đƣợc sử dụng phổ biến đến nay. Phƣơng pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt.
Tiến hành:
- Sau khi đo nồng độ DNA khuôn,tính và tạo các nồng độ DNA của mẫu đạt khoảng 50 ng trong tổng thể tích là 25 µl cho 1 phản ứng.
- Tính lƣợng thể tích các thành phần khác trong phản ứng,trộn đều các thành phần rồi vào các ống đã có khuôn DNA.
- Đặt các ống chứa hỗn hợp phản ứng vào máy PCR, khởi động,cài đặt chu kỳ và cho máy chạy.
* Sử dụng cặp mồi 341f và 907r do hãng Alpha (Canada) tổng hợp,đây là cặp mồi đƣợc thiết kế thành công dựa trên trình tự bảo thủ của công đoạn gene mã hoá 16S rRNA và có khả năng khuếch đại đoạn gen kích thƣớc khoảng 500 bp,với trình tự:
34lf : 5’ – CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’ 907r : 5 ’- CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT- 3’
* Hỗn hợp phản ứng PCR ( 25 µl ) gồm các thành phần nhƣ sau: Buffer Taq (10X) : 2,5 µl Mồi xuôi ( 20 µM ) : 0,75 µl BSA ( 25mM) : 1 µl Mồi ngƣợc ( 20 µM ) : 0,75 µl dNTPs (10nM) : 2 µl Taq ( 5 U/µl ) : 0,3 µl DNA khuôn (20ng/ µl) : 2 µl dH20 : 15,7 µl
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch theo quy trình hƣớng dẫn của bộ Kit AccuPrep PCR Puirfication (hãng Bioneer).
Phƣơng pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch và gửi xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer theo phƣơng pháp của Sanger. Trình tự nucleotide đƣợc sử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3.100 Avant Data Collectino v 1.0 và trình tự DNA đó đƣợc so sánh với trình tự của các vi khuẩn đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen thế giới.
Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại:
Tiến hành so sánh trình tự gen mã hoá 16S rRNA của chủng vi sinh vật thu đƣợc với đoạn gen có kích thƣớc và vị trí tƣơng tự ở các sinh vật đã đƣợc công bố trong ngân hàng dữ liệu gen thế giới NCBI (sử dụng chƣơng trình Blast để so sánh độ tƣơng đồng) và sử dụng các phần mềm Bioedit, Clustal X, Mega 4 để xây dựng cây phát sinh chủng loại.
CHƢƠNG IV:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả lấy mẫu đất và nƣớc thải.
- Mẫu đất và nƣớc thải tại cây xăng Việt Hoàng, xã Yên Đổ, huyện Phú Lƣơng, tỉnh Thái Nguyên đƣợc chúng tôi thu thập tại các vị trí khác nhau. Đất có màu nâu sẫm,có mùi hôi. Nƣớc thải có màu đen sẫm,có váng dầu và có mùi hôi thối (Hình 4.1).
Hình 4.1. Mẫu đất và nước tại kho xăng Việt Hoàng, xã Yên Đổ, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên
4.2. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu DO
Từ mẫu ban đầu, vi sinh vật sử dụng dầu DO đƣợc làm giàu và phân lập trên môi trƣờng muối khoáng Gost dịch có bổ sung 1% dầu diesel.
Sau 3 lần làm giàu chúng tôi nhận thấy,màu sắc và độ đục của môi trƣờng thay đổi rõ rệt so với nguồn mẫu nƣớc thải ban đầu ( Hình 4.2a, 4.2b, 4.2c). So với lần làm giàu thứ nhất,lần làm giàu thứ 2 và thứ 3 chúng tôi quan sát thấy sau 24h nuôi lắc,màu môi trƣờng thay đổi rõ rệt và sinh khối ngày càng tăng lên điều đó cho thấy phần nào sự phát triển nhanh chóng của các vi sinh vật trong mẫu nƣớc thải. Khi nuôi vi sinh vật trong môi trƣờng muối
Mẫu nƣớc Mẫu đất
khoáng Gost nghèo dinh dƣỡng có bổ sung dầu diesel,vi sinh vật sẽ sử dụng dầu diesel đó nhƣ là nguồn carbon và năng lƣợng duy nhất thông qua sự phát triển của vi sinh vật cũng phần nào đánh giá đƣợc khả năng phân hủy dầu diesel của chúng.
K Mẫu nƣớc Mẫu đất
Hình 4.2a. Làm giàu lần 1 trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 1% dầu DO
K Mẫu nƣớc Mẫu đất
Hình 4.2b. Làm giàu lần 2 trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 1% dầu DO
K Mẫu nƣớc Mẫu đất
Hình 4.2c. Làm giàu lần 3 trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 1% dầu DO
Sau lần làm giàu thứ 3, chúng tôi đã tiến hành pha loãng tới hạn và cấy gạt kiểm tra trên môi trƣờng muối khoáng Gost thạch có bổ sung nguồn cơ chất tƣơng ứng. Sau 7 ngày một số vi sinh vật trên môi trƣờng muối khoáng Gost thạch đã đƣợc thu nhận. Các chủng vi khuẩn sau đó đƣợc tách riêng và làm sạch. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 4.3
Hình 4.3: Tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng muối khoáng Gost thạch
Kết quả ở hình 4.3 cho thấy, vi sinh vật phát triển trên môi trƣờng muối khoáng Gost thạch rất đa dạng và phong phú.
Các chủng vi sinh vật phát triển trên đĩa thạch đƣợc chúng tôi tiến hành làm sạch và quan sát hình thái khuẩn lạc (Bảng 4.1).
Bảng 4.1. Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được
Chủng Nguồn gốc Đặc điểm khuẩn lạc
G1 N0.10-3 Tròn, dẹp, trắng đục, mép nhăn, d=1,2-1,8 mm
G2 Đ2.10-5 Tròn, lồi, bóng, ƣớt, trắng đục, d=0,8-1,5 mm
G3 N1.10-3 Tròn, xanh trong, dẹt, d=1,8-2 mm
G4 Đ1.10-5 Tròn, bóng, màu vàng nhạt, d=0,5-0,8 mm
G5 N2.10-5 Tròn, bóng, màu vàng nghệ, d = 1,2 -1,5
G6 N2.10-5 Tròn, dẹt, màu xanh trong, d = 1,8-2,2 mm
G7 Đ1.10-5 Tròn, trắng, dẹt, d = 2-3 mm
G8 Đ2.10-5 Tròn, dẹt, mép nhăn, màu trắng đục, d=1-1,2 mm
G9 Đ2.10-3 Tròn, lồi, màu vàng nghệ, d=1,8-2 mm
G10 N2.10-1 Tròn, lồi, bóng, ƣớt, trắng đục, d=1,8-2,2 mm
N: Phân lập từ mẫu nước; Đ: Phân lập từ mẫu đất; 10x: Độ pha loãng; N(Đ)y: y là số lần làm giàu tưng ứng lần 1, lần 2, lần 3
Để khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của từng chủng, chúng tôi tách chủng riêng biệt và nuôi lắc trên 20 ml môi trƣờng muối khoáng Gost dịch có bổ sung dầu diesel với nồng độ tăng dần từ 1%; 2%; 5% đến 10%.
Đối vối nồng độ dầu diesel 1% sau 5 ngày nuôi cấy kết quả cho thấy màu sắc của từng chủng thay đổi rõ rệt và lƣợng sinh khối bám trên thành bình cũng khác nhau ( Hình 4.4) .
Hình 4.4. Đặc điểm dịch nuôi chủng vi khuẩn trên môi trường muối khoáng có bổ sung 1% dầu diesel sau 7 ngày nuôi cấy.
K: Mẫu đối chứng không có vi sinh vật
Để đánh giá xem chủng vi khuẩn nào có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh nhất, sau mỗi ngày, mẫu đƣợc tiến hành đo OD tại bƣớc sóng 600 nm để đánh giá sự sinh trƣởng và phát triển của chúng. Quá trình đánh giá đƣợc tiến hành trong 7 ngày. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Khả năng sinh trưởng trên môi trường có 1% dầu diesel của 10 chủng vi khuẩn
Tên chủng
Giá trị OD tại bƣớc sóng 600 nm
Ngày 0 Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7
G1 0,3 0,42 0,76 0,64 0,46 G2 0,3 1,62 2,06 3,92 3,17 G3 0,3 0,72 0,76 0,65 0,56 G4 0,3 0,55 1,36 1,87 1,78 G5 0,3 0,59 0,95 0,63 0,41 G6 0,3 1,54 2,23 3,47 2,94 G7 0,3 0,75 1,24 1,98 2,19 G8 0,3 1,86 3,61 3,5 3,36 G9 0,3 0,98 1,56 0,79 0,43 G10 0,3 2,704 3,84 4,45 3,28 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 K
Để thấy rõ hơn khả năng phân hủy 1% dầu diesel của 10 chủng đơn trong khoảng thời gian 7 ngày với giá trị OD tại bƣớc sóng 600nm chúng tôi đã xây dựng đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng của 10 chủng vi khuẩn (Hình 4.5).
Hình 4.5. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn ở nồng độ 1% dầu diesel
Kết quả khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của 10 chủng đơn ở nồng độ 1% dầu diesel cho thấy có 6 chủng có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh đó là chủng G2; G4; G6; G7; G8; G10. Các chủng còn lại cũng phát triển nhƣng yếu hơn. Các chủng G2; G4; G6; G7; G8; G10 đƣợc sử dụng để đánh giá về khả năng sử dụng dầu DO tại nồng độ 2%.
Để khảo sát khả năng sinh trƣởng và phát triển trong môi trƣờng dầu DO với nồng độ 2% của 6 chủng G2; G4; G6; G7; G8; G10. Các chủng này đã đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng Gost có bổ sung 2% dầu DO.
Sau 7 ngày nuôi lắc, màu sắc và số lƣợng sinh khối có sự thay đổi ( Hình 4.6). Bên cạnh đó khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trƣờng Gost có dầu DO ở nồng độ 2% cũng có sự thay đổi sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau ( Bảng 4.3, Hình 4.7).
Hình 4.6.Khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường có 2% dầu diesel
K: là mẫu đối chứng không có vi sinh vật
Bảng 4.3. Khả năng sinh trưởng trên môi trường có dầu diesel 2% của 6 chủng vi khuẩn.
Tên chủng Giá trị OD tại bƣớc sóng 600 nm
Ngày 0 Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7
G2 0,32 1,28 1,77 2,34 1,88 G4 0,22 0,48 0,88 0,59 0,37 G6 0,3 1,15 1,74 2,18 1,54 G7 0,19 0,36 0,57 1,21 0,96 G8 0,34 0,96 2,38 1,88 1,25 G10 0,33 1,68 2,18 3,46 2,22
Hình 4.7. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn ở nồng độ 2% dầu diesel
K G2 G4 G6 G7 G8 G10
Chủng vi khuẩn
Trong 6 chủng lựa chọn, có 5 chủng G2; G6; G7; G8; G10 có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh trên nồng độ dầu DO 2% do vậy 5 chủng này đƣợc lựa chọn để nghiên cứu tiếp khả năng sinh trƣởng và phát triển của chúng ở nồng độ 5% dầu diesel.
Hình 4.8. Khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường có 5% dầu Diesel
K: là mẫu đối chứng không có vi sinh vật
Cũng nhƣ khả năng phát triển trong môi trƣờng có 1% và 2% dầu
diesel, khi tăng lên 5% trong môi trƣờng muối khoáng Gost với sự có mặt của 5 chủng vi khuẩn riêng rẽ màu sắc và lƣợng sinh khối cũng thay đổi khác nhau( Hình 4.8).
Trong các khoảng thời gian nuôi lắc khác nhau trong môi trƣờng có 5% DO, 5 chủng G2; G6; G7; G8; G10 có sự sinh trƣởng và phát triển khác nhau ( Bảng 4.4, Hình 4.9).
Bảng 4.4. Khả năng sinh trưởng trên môi trường có dầu diesel 5% của 5 chủng vi khuẩn
Tên chủng Giá trị OD tại bƣớc sóng 600 nm
Ngày 0 Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7
G2 0,2 0,54 0,86 1,59 1,16
G6 0,16 0,37 0,58 1,35 0,93
G7 0,1 0,26 0,65 0,88 0,62
G8 0,15 0,41 1,43 1,02 0,74
G10 0,23 0,67 1,99 2,86 1,68
Hình 4.9. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn ở nồng độ 5% dầu diesel
Kết quả ở bảng 4.4 và hình 4.9 cho thấy, có 4 chủng vi khuẩn có khả năng sinh trƣởng và phát triển tốt tại nồng độ DO 5%. Đó là G2; G6; G8; G10 bốn chủng này tiếp tục đƣợc sử dụng để đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của chúng trên môi trƣờng chứa 10% dầu DO(Hình 4.10, Bảng 4.5).
Hình 4.10. Khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường có 10% dầu diesel
K: là mẫu đối chứng không có vi sinh vật
Quan sát hình 4.10 ta nhận thấy màu sắc của môi trƣờng muối khoáng Gost chứa bốn chủng vi khuẩn G2; G6; G8; G10 khi tăng nồng độ 10% dầu diesel có sự thay đổi và lƣợng sinh khối bám trên thành bình cũng thay đổi.
Khả năng sinh trƣởng và phát triển ở các giai đoạn thời gian khác nhau có những sự biến động nhất định( Bảng 4.5, Hình 4.11).
Bảng 4.5. Khả năng sinh trưởng trên môi trường có dầu diesel 10% của 4 chủng vi khuẩn
Tên chủng Giá trị OD tại bƣớc sóng 600 nm
Ngày 0 Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7
G2 0,18 0,312 0,84 1,06 0,79 G6 0,1 0,29 0,69 0,97 0,505 G8 0,07 0,28 0,61 0,48 0,29 G10 0,18 0,54 1,094 2,504 1,53 G2 G6 G8 G10 K
Từ bảng 4.5 và hình 4.11 chúng tôi nhận thấy chủng G10 có khả năng sinh trƣởng và phát triển tốt nhất. Vì vậy chủng này đã đƣợc chọn để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo.
Hình 4.11. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
4.3. Đặc điểm sinh học của chủng G10
Chủng G10 thuộc nhóm Gram dƣơng. Khuẩn lạc trên môi trƣờng MPA
thạch sau 24 giờ nuôi cấy có hình tròn,lồi,bóng,ƣớt,màu trắng đục,đƣờng kính 1,8 ÷ 2,2 mm(Hình 4.12 A),tế bào có dạng hình que ngắn,hai đầu tù, kích thƣớc 0,6 ÷ 0,8 x 1,6 ÷ 2,3 m.( Hình 4.12 B).
A: Đặc điểm khuẩn lạc chủng B: Hình dáng tế bào chủng
vi khuẩn G10 vi khuẩn G10
Hình 4.12. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng G10
4.4. Phân loại định tên và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự đoạn gen mã hoá 16S rRNA của chủng vi khuẩn G10. trình tự đoạn gen mã hoá 16S rRNA của chủng vi khuẩn G10.
Chủng G10 đƣợc phân loại và định tên bằng phƣơng pháp phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng G10 đã đƣợc xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100. Sau khi phân tích và xử lý số liệu,trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng vi khuẩn này đƣợc thể hiện ở hình 4.13.
1 agcttgctct cgggtgacga gcggcggacg ggtgagtaat gtctgggaaa ctgcctgatg 61 gagggggata actactggaa acggtagcta ataccgcata acgtcgcaag accaaagtgg 121 gggaccttcg ggcctcatgc catcagatgt gcccagatgg gattagctag taggtggggt 181 aacggctcac ctaggcgacg atccctagct ggtctgagag gatgaccagc cacactggaa 241 ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc 301 aagcctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt cgggttgtaa agcactttca 361 gcggggagga aggcgttgag gttaataacc tcgtcgattg acgttacccg cagaagaagc 421 accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt taatcggaat 481 tactgggcgt aaagcgcacg caggcggtct gtcaagtcgg atgtgaaatc cccgggctca 541 acctgggaac tgcattcgaa actggcaggc tagagtcttg tagagggggg tagaattcca 601 ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg gtggcgaagg cggccccctg 661 gacaaagact gacgctcagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 721 agtccacgcc gtaaacgatg tcgatttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg gcttccggag 781 ctaacgcgtt aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt 841 gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct 901 tacctggtct tgacatccac agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactgtg 961 agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca 1021 acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag cggttaggcc gggaactcaa aggagactgc 1081 cagtgataaa ctggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgaccagg 1141 gctacacacg tgctacaatg gcatatacaa agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac 1201 ctcataaagt atgtcgtagt ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat 1261 cgctagtaat cgtagatcag aatgctacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1321 cccgtcacac catgggagtg ggttgcaaaa gaagtaggta gcttaacctt cgggagggcg 1381 cttaccactt tg
Hình 4.13. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn G10
Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng G10 với các chủng vi