2. 1 Tình hìn hô nhiễm dầu trên thế giới:
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu:
3.2.1. Thu thập mẫu:
Mẫu đất và nƣớc nhiễm dầu đƣợc chúng tôi thu thập tại kho xăng Việt Hoàng thuộc xã Yên Đổ, huyện Phú Lƣơng, tỉnh Thái Nguyên. Tại các vị trí lấy mẫu, đối với nƣớc ta tiến hành khuấy đảo để trộn đều các thành phần kết lắng trong nƣớc,đảm bảo mẫu thu đƣợc có tính đại diện và đặc trƣng cho vùng bị ô nhiễm. Sau đó,sử dụng gáo múc mẫu nƣớc thải vào các chai chuyên dụng để lấy mẫu đã đƣợc rửa sạch và buộc kín miệng. Mẫu lấy về đƣợc bảo
quản ở tủ lạnh 4oC tại phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng,Viện Công nghệ Sinh học,Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để đảm bảo tính chất và thành phần mẫu không bị thay đổi để phục vụ các nghiên cứu.
3.2.2. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel.
Từ mẫu ban đầu, tiến hành làm giàu 3 lần trên 50 ml môi trƣờng muối khoáng Gost có bổ sung 0,1% vitamin,1% dầu diesel,nuôi lắc ở 200 vòng/phút ở 37o
C trong 7 ngày.
Tìm kiếm tập đoàn vi sinh vật và phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel đƣợc truyển chọn sau 3 lần làm giàu dựa vào màu sắc và hình thái khuẩn lạc.
3.2.3. Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn.
Nguyên lý:
Khi nuôi vi sinh vật trong môi trƣờng muối khoáng Gost nghèo dinh dƣỡng có bổ sung dầu DO,vi sinh vật sẽ sử dụng dầu DO nhƣ là nguồn carbon và năng lƣợng cho sinh trƣởng. Sự phát triển của vi sinh vật đƣợc đánh giá định tính thông qua sự thay đổi độ đục của môi trƣờng nuôi cấy và lƣợng sinh khối bám trên thành bình.
Tiến hành:
- Nuôi qua đêm để làm tƣơi mới chủng, thu lƣợng sinh khối đầu vào OD 600 là 0,3 để khảo sát khả năng sử dựng dầu DO của chủng vi khuẩn
- Bổ sung dịch sinh khối mỗi chủng đơn vào bình tam giác dung tích 100ml có chứa 20ml Gost dịch có bổ sung dầu diesel với nồng độ tăng dần từ 1%; 2%; 5% đến 10%.
- Đem nuôi ở tủ lắc 37oC, ở 200 vòng/phút và quan sát sự thay đổi màu, lƣợng sinh khối bám trên thành bình và đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 600nm ( OD600 ) sau mỗi ngày.
3.2.4. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn:
Nhuộm Gram theo phƣơng pháp Hucker cải tiến [40].
Nguyên lý:
Dựa vào cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để phát hiện các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc nhóm Gr (+) hay Gr (-).
Tiến hành :
Nhỏ một giọt nƣớc vô trùng lên lam kính, dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào giọt nƣớc đó, dàn mỏng giọt huyền phù, hong khô và cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím kết tinh ( crystal violet ) trong 1 phút, rửa bằng nƣớc cất, thấm khô, sau đó nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol, để trong 1 phút. Đổ dung dịch lugol, rửa nhanh qua bằng cồn 96oC, rửa nƣớc, thấm nhẹ xung quanh vết bôi. Nhuộm tiếp với safranin 1 phút, rửa lại bằng nƣớc và để khô. Mẫu đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100 lần dƣới vật kính dầu. Vi khuẩn Gr (-) bắt màu hồng, vi khuẩn Gr (+) bắt màu xanh đậm. Đối chứng cho vi khuẩn Gr(-) là E.coli bắt màu hồng và vi khuẩn Gr (+) là Bacillus bắt màu xanh đậm.
Phương pháp xác định hình thái tế bào trên kính hiển vi điện tử quét:
Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng lỏng có chứa nguồn cơ chất thích hợp. Sau hai ngày tiến hành quan sát: Sinh khối đƣợc lọc qua giấy lọc vô trùng rồi đem ly tâm 5.000 vòng/phút trong 5 phút, rửa tách lấy tế bào. Tế bào vi khuẩn đƣợc hòa tan trong glutaraldehyt 2,5% trong đệm photphat natri 100 mM ( pH 7,2 )trong 30 phút. Lấy một giọt tế bào đã xử lý (106
- 108 tế bào/ml )đƣa lên 1 tấm phim mỏng và để 1 phút để cho mẫu bám đƣợc vào lƣới vàng. Rửa nhẹ nhàng với vài giọt nƣớc cất và mẫu đƣợc làm khô qua cồn 25, 50, 75 và 100%, chuyển qua T - butyl. Sau đó mẫu đƣợc làm khô bằng máy đông khô và phủ bằng vàng. Mẫu đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV. Hình thái tế bào vi khuẩn đƣợc
chụp ảnh và đo kích thƣớc. Cố định mẫu và soi kính đƣợc thực hiện tại Viện 69, Bộ Tƣ lệnh Lăng.
* Tìm kiếm tập đoàn vi sinh vật và phân lập một số chủng vi khuẩn có
khả năng sử dụng dầu diesel được tuyển chọn sau 3 lần làm giàu dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc
3.2.5. Đánh giá ảnh hƣởng của một số điều kiện hóa lý tới khả năng phân hủy dầu diesel: hủy dầu diesel:
Đánh giá khả năng phân hủy 10% dầu diesel của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng muối khoáng Gost, có dải pH ( 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 và 9) và các nồng độ muối NaCl khác nhau ( 0%; 0,5%; 1%; 1,5%; 2% ) trong điều kiện nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37o
C.
3.2.6. Xác định khả năng phân hủy dầu diesel của vi khuẩn:
Chủng vi khuẩn chọn lựa đƣợc nuôi cấy trên 50ml môi trƣờng muối khoáng Gost, bổ sung 10% dầu diesel. Sau 7 ngày nuôi lắc ở 37oC và với tốc độ 200 vòng/phút tiến hành định lƣợng hàm lƣợng dầu diesel của mẫu chứa chủng vi khuẩn và mẫu đối chứng,lƣợng dầu diesel đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phân tích khối lƣợng theo tiêu chuẩn TCVN 4582-88 tại Viện Hóa Công nghiệp.
3.2.7. Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật dựa vào xác định trình tự đoạn trên mã hóa 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại: trên mã hóa 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại:
* Tách chiết DNA tổng số
Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số [44].
Nguyên tắc:
DNA tổng số đƣợc tách chiết theo các bƣớc cơ bản sau: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân loại bỏ protein tủa DNA. Để thu đƣợc DNA sạch ta cần loại bỏ các thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protrein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleicacid/proteins) trong hai pha không hòa tan ( phenol, chloroform/nƣớc
). Tiến hành tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào ( DNase và Rnase ).
Tiến hành:
- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào eppendorf 1,5 ml,ly tâm 7.000 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ dịch,thu sinh khối,rửa 2 lần bằng đệm natri phosphate (pH 8).
- Bổ sung 540 l, extration buffer, vortex kỹ.
- Bổ sung 20µl protease K (20 mg/ml, lắc ở 370C trong vòng 30 phút. - Bổ sung 60 µl SDS (sodium Doecyl Sufate) 20% rồi ủ ở 65oC trong 2h hoặc lắc qua đêm.
- Bổ sung 600 µl Cl (Chlororm : Isoamylalchohol = 24:1), ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút. Hút pha trên,lặp lại 1-2 lần tuỳ thuộc vào mẫu bẩn hay mẫu sạch.
- Kết tủa DNA bằng isopanol bằng 6 lần thể tích dịch pha trên,ủ ở nhiệt độ phòng từ 1 - 2giờ.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 0C, thu DNA.
- Rửa tủa bằng 500 µl ethanol lạnh 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0C rồi bỏ dịch .
- Để khô tự nhiênvà hoà tan tủa trong 25 - 30 µl nƣớc khử ion vô trùng. * Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR:
Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [35]. Phƣơng pháp này đã tạo ra bƣớc nhảy vọt trong kỹ thuật sinh học phân tử và đƣợc sử dụng phổ biến đến nay. Phƣơng pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt.
Tiến hành:
- Sau khi đo nồng độ DNA khuôn,tính và tạo các nồng độ DNA của mẫu đạt khoảng 50 ng trong tổng thể tích là 25 µl cho 1 phản ứng.
- Tính lƣợng thể tích các thành phần khác trong phản ứng,trộn đều các thành phần rồi vào các ống đã có khuôn DNA.
- Đặt các ống chứa hỗn hợp phản ứng vào máy PCR, khởi động,cài đặt chu kỳ và cho máy chạy.
* Sử dụng cặp mồi 341f và 907r do hãng Alpha (Canada) tổng hợp,đây là cặp mồi đƣợc thiết kế thành công dựa trên trình tự bảo thủ của công đoạn gene mã hoá 16S rRNA và có khả năng khuếch đại đoạn gen kích thƣớc khoảng 500 bp,với trình tự:
34lf : 5’ – CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’ 907r : 5 ’- CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT- 3’
* Hỗn hợp phản ứng PCR ( 25 µl ) gồm các thành phần nhƣ sau: Buffer Taq (10X) : 2,5 µl Mồi xuôi ( 20 µM ) : 0,75 µl BSA ( 25mM) : 1 µl Mồi ngƣợc ( 20 µM ) : 0,75 µl dNTPs (10nM) : 2 µl Taq ( 5 U/µl ) : 0,3 µl DNA khuôn (20ng/ µl) : 2 µl dH20 : 15,7 µl
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch theo quy trình hƣớng dẫn của bộ Kit AccuPrep PCR Puirfication (hãng Bioneer).
Phƣơng pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch và gửi xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer theo phƣơng pháp của Sanger. Trình tự nucleotide đƣợc sử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3.100 Avant Data Collectino v 1.0 và trình tự DNA đó đƣợc so sánh với trình tự của các vi khuẩn đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen thế giới.
Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại:
Tiến hành so sánh trình tự gen mã hoá 16S rRNA của chủng vi sinh vật thu đƣợc với đoạn gen có kích thƣớc và vị trí tƣơng tự ở các sinh vật đã đƣợc công bố trong ngân hàng dữ liệu gen thế giới NCBI (sử dụng chƣơng trình Blast để so sánh độ tƣơng đồng) và sử dụng các phần mềm Bioedit, Clustal X, Mega 4 để xây dựng cây phát sinh chủng loại.
CHƢƠNG IV:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả lấy mẫu đất và nƣớc thải.
- Mẫu đất và nƣớc thải tại cây xăng Việt Hoàng, xã Yên Đổ, huyện Phú Lƣơng, tỉnh Thái Nguyên đƣợc chúng tôi thu thập tại các vị trí khác nhau. Đất có màu nâu sẫm,có mùi hôi. Nƣớc thải có màu đen sẫm,có váng dầu và có mùi hôi thối (Hình 4.1).
Hình 4.1. Mẫu đất và nước tại kho xăng Việt Hoàng, xã Yên Đổ, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên
4.2. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu DO
Từ mẫu ban đầu, vi sinh vật sử dụng dầu DO đƣợc làm giàu và phân lập trên môi trƣờng muối khoáng Gost dịch có bổ sung 1% dầu diesel.
Sau 3 lần làm giàu chúng tôi nhận thấy,màu sắc và độ đục của môi trƣờng thay đổi rõ rệt so với nguồn mẫu nƣớc thải ban đầu ( Hình 4.2a, 4.2b, 4.2c). So với lần làm giàu thứ nhất,lần làm giàu thứ 2 và thứ 3 chúng tôi quan sát thấy sau 24h nuôi lắc,màu môi trƣờng thay đổi rõ rệt và sinh khối ngày càng tăng lên điều đó cho thấy phần nào sự phát triển nhanh chóng của các vi sinh vật trong mẫu nƣớc thải. Khi nuôi vi sinh vật trong môi trƣờng muối
Mẫu nƣớc Mẫu đất
khoáng Gost nghèo dinh dƣỡng có bổ sung dầu diesel,vi sinh vật sẽ sử dụng dầu diesel đó nhƣ là nguồn carbon và năng lƣợng duy nhất thông qua sự phát triển của vi sinh vật cũng phần nào đánh giá đƣợc khả năng phân hủy dầu diesel của chúng.
K Mẫu nƣớc Mẫu đất
Hình 4.2a. Làm giàu lần 1 trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 1% dầu DO
K Mẫu nƣớc Mẫu đất
Hình 4.2b. Làm giàu lần 2 trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 1% dầu DO
K Mẫu nƣớc Mẫu đất
Hình 4.2c. Làm giàu lần 3 trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 1% dầu DO
Sau lần làm giàu thứ 3, chúng tôi đã tiến hành pha loãng tới hạn và cấy gạt kiểm tra trên môi trƣờng muối khoáng Gost thạch có bổ sung nguồn cơ chất tƣơng ứng. Sau 7 ngày một số vi sinh vật trên môi trƣờng muối khoáng Gost thạch đã đƣợc thu nhận. Các chủng vi khuẩn sau đó đƣợc tách riêng và làm sạch. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 4.3
Hình 4.3: Tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng muối khoáng Gost thạch
Kết quả ở hình 4.3 cho thấy, vi sinh vật phát triển trên môi trƣờng muối khoáng Gost thạch rất đa dạng và phong phú.
Các chủng vi sinh vật phát triển trên đĩa thạch đƣợc chúng tôi tiến hành làm sạch và quan sát hình thái khuẩn lạc (Bảng 4.1).
Bảng 4.1. Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được
Chủng Nguồn gốc Đặc điểm khuẩn lạc
G1 N0.10-3 Tròn, dẹp, trắng đục, mép nhăn, d=1,2-1,8 mm
G2 Đ2.10-5 Tròn, lồi, bóng, ƣớt, trắng đục, d=0,8-1,5 mm
G3 N1.10-3 Tròn, xanh trong, dẹt, d=1,8-2 mm
G4 Đ1.10-5 Tròn, bóng, màu vàng nhạt, d=0,5-0,8 mm
G5 N2.10-5 Tròn, bóng, màu vàng nghệ, d = 1,2 -1,5
G6 N2.10-5 Tròn, dẹt, màu xanh trong, d = 1,8-2,2 mm
G7 Đ1.10-5 Tròn, trắng, dẹt, d = 2-3 mm
G8 Đ2.10-5 Tròn, dẹt, mép nhăn, màu trắng đục, d=1-1,2 mm
G9 Đ2.10-3 Tròn, lồi, màu vàng nghệ, d=1,8-2 mm
G10 N2.10-1 Tròn, lồi, bóng, ƣớt, trắng đục, d=1,8-2,2 mm
N: Phân lập từ mẫu nước; Đ: Phân lập từ mẫu đất; 10x: Độ pha loãng; N(Đ)y: y là số lần làm giàu tưng ứng lần 1, lần 2, lần 3
Để khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của từng chủng, chúng tôi tách chủng riêng biệt và nuôi lắc trên 20 ml môi trƣờng muối khoáng Gost dịch có bổ sung dầu diesel với nồng độ tăng dần từ 1%; 2%; 5% đến 10%.
Đối vối nồng độ dầu diesel 1% sau 5 ngày nuôi cấy kết quả cho thấy màu sắc của từng chủng thay đổi rõ rệt và lƣợng sinh khối bám trên thành bình cũng khác nhau ( Hình 4.4) .
Hình 4.4. Đặc điểm dịch nuôi chủng vi khuẩn trên môi trường muối khoáng có bổ sung 1% dầu diesel sau 7 ngày nuôi cấy.
K: Mẫu đối chứng không có vi sinh vật
Để đánh giá xem chủng vi khuẩn nào có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh nhất, sau mỗi ngày, mẫu đƣợc tiến hành đo OD tại bƣớc sóng 600 nm để đánh giá sự sinh trƣởng và phát triển của chúng. Quá trình đánh giá đƣợc tiến hành trong 7 ngày. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Khả năng sinh trưởng trên môi trường có 1% dầu diesel của 10 chủng vi khuẩn
Tên chủng
Giá trị OD tại bƣớc sóng 600 nm
Ngày 0 Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7
G1 0,3 0,42 0,76 0,64 0,46 G2 0,3 1,62 2,06 3,92 3,17 G3 0,3 0,72 0,76 0,65 0,56 G4 0,3 0,55 1,36 1,87 1,78 G5 0,3 0,59 0,95 0,63 0,41 G6 0,3 1,54 2,23 3,47 2,94 G7 0,3 0,75 1,24 1,98 2,19 G8 0,3 1,86 3,61 3,5 3,36 G9 0,3 0,98 1,56 0,79 0,43 G10 0,3 2,704 3,84 4,45 3,28 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 K
Để thấy rõ hơn khả năng phân hủy 1% dầu diesel của 10 chủng đơn trong khoảng thời gian 7 ngày với giá trị OD tại bƣớc sóng 600nm chúng tôi đã xây dựng đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng của 10 chủng vi khuẩn (Hình 4.5).
Hình 4.5. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn ở nồng độ 1% dầu diesel
Kết quả khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của 10 chủng đơn ở nồng độ 1% dầu diesel cho thấy có 6 chủng có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh đó là chủng G2; G4; G6; G7; G8; G10. Các chủng còn lại cũng phát triển nhƣng yếu hơn. Các chủng G2; G4; G6; G7; G8; G10 đƣợc sử dụng để đánh giá về khả năng sử dụng dầu DO tại nồng độ 2%.
Để khảo sát khả năng sinh trƣởng và phát triển trong môi trƣờng dầu DO với nồng độ 2% của 6 chủng G2; G4; G6; G7; G8; G10. Các chủng này đã đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng Gost có bổ sung 2% dầu DO.
Sau 7 ngày nuôi lắc, màu sắc và số lƣợng sinh khối có sự thay đổi ( Hình 4.6). Bên cạnh đó khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trƣờng Gost có dầu DO ở nồng độ 2% cũng có sự thay đổi sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau ( Bảng 4.3, Hình 4.7).