Với đầu vào là dữ liệu thực nghiệm theo Bảng 3.12, phần mềm thông minh FormRules v3.3 (2007) với tùy chọn Minimum Description Length (MDL) đã phân tích mối liên quan nhân quả như sau:
Bảng 3.13. Liên quan nhân quả trong quy trình chiết xuất cao Diếp cá
x1 x2 x3 R2 luyện
y1 + + + 100
y2 + + + 100
Hiệu suất chiết và hàm lượng quercetin có liên quan trực tiếp với tất cả 3 yếu tố khảo sát là độ cồn, tỷ lệ DL/DM và số lần chiết.
Sự liên quan nhân quả nêu trên theo những qui luật sau đây:
Đối với hiệu suất chiết
Nếu x1 thấp thì y1 sẽ cao (1,00) Nếu x1 cao thì y1 sẽ thấp (0,57)
Hình 3.6. Ảnh hưởng của độ cồn và tỷ lệ DL/DM trên hiệu suất chiết
Đối với hàm lượng quercetin
Nếu x1 thấp thì y2 thấp (0,81) Nếu x1 trung bình thì y2 cao (1,00) Nếu x1 cao thì y2 cao (1,00)
Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ cồn và số lần chiết trên hàm lượng quercetin 3.3.3. Tối ưu hóa thông số
Dữ liệu trong Bảng 3.12 trình bày các yếu tố đầu vào cho phần mềm thông minh INForm. Với nhóm thử gồm 2 mẫu 6 & 11 và thuật toán RPROP, các mô hình liên quan nhân quả được thiết lập và đánh giá về mặt thống kê theo Bảng 3.14.
Bảng 3.14. Đánh giá các mô hình nhân quả đối với cao Diếp cá
Giá trị R2 y1 y2
Nhóm luyện 98,8995% 93,9556%
Nhóm thử 95,2353% 96,2910%
Mô hình y1 có tính tương thích tốt (R2 = 98,8995%) và khả năng dự đoán chính xác (R2 = 95,2353%). Mô hình y2 có tính tương thích tốt (R2 = 93,9556%) và khả năng dự đoán khá chính xác (R2 = 96,2910%). Cả hai mô hình đều có thể được áp dụng trong giai đoạn tối ưu hóa thông số.
Điều kiện tối ưu hóa
x3 = Số lần chiết = số nguyên dương y1 = Hiệu suất = max = Up
y2 = Hàm lượng quercetin = max = Up
Kết quả tối ưu hóa
Thông số tối ưu Tính chất dự đoán
x1 = Độ cồn = B y1 = Hiệu suất = 0,0763
y2 = Hàm lượng quercetin = 0,0027 x2 = Tỷ lệ DL/DM = 1/8
x3 = Số lần chiết = 2
3.3.4. Thực nghiệm kiểm chứng quy trình tối ưu
Nhằm kiểm chứng kết quả của quy trình tối ưu, dược liệu Diếp cá được chiết xuất hai lần với cùng điều kiện và quy trình. Sản phẩm được kiểm tra hiệu suất và kiểm nghiệm hàm lượng quercetin và được so sánh với giá trị dự đoán cho bới phần mềm INForm (Bảng 3.15).
Bảng 3.15. Kết quả thực nghiệm và giá trị dự đoán của dược liệu Diếp cá
Tính chất sản phẩm Thực nghiệm Dự đoán
Lần 1 Lần 2 TB
Hiệu suất (%) 7,050 7,235 7,143 7,63
Hàm lượng quercetin (%) 0,3 0,293 0,297 0,27
Phân tích phương sai hai yếu tố không lặp đối với dữ liệu thực nghiệm cho kết quả F = 0,1975 < F0,05 = 161,44. Vậy quy trình của sản phẩm có tính lặp lại (p > 0,05). Phân tích phương sai hai yếu tố không lặp đối với dữ liệu dự đoán (INForm) với dữ liệu thực nghiệm (trung bình) cho kết quả F = 0,8 < F0,05 = 161,44. Vậy các giá trị dự đoán bởi phần mềm INForm so với giá trị thực nghiệm (trung bình) khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05).
3.4. KIỂM NGHIỆM CAO DIẾP CÁ3.4.1. Hình thức cảm quan 3.4.1. Hình thức cảm quan
Bột nửa mịn, màu nâu sẫm, mùi đặc trưng, rất dễ hút ẩm.
3.4.2. Độ tan trong nước
Kết quả: cao Diếp cá khó tan trong nước.
3.4.3. Độ tan trong cồn
Kết quả: cao Diếp cá tan trong cồn thấp độ (10-60%), khó tan trong cồn cao độ (70-96%).
3.4.4. Cắn không tan trong nước
Bảng 3.16. Cắn không tan trong nước của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Cắn không tan trong nước (%) 31,36 32,18 33,98 32,51
3.4.5. Độ ẩm
Bảng 3.17. Độ ẩm của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Độ ẩm (%) 5,545 5,671 5,786 5,67
3.4.6. Độ tro
3.4.6.1. Tro toàn phần
Bảng 3.18. Tro toàn phần của cao Diếp cá
Tro toàn phần (%) 18,38 16,53 18,29 17,73
3.4.6.2. Tro không tan trong acid hydrochlorid
Bảng 3.19. Tro không tan trong acid hydrochlorid của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tro không tan trong acid (%) 0,58 0,52 0,55 0,55
3.4.6.3. Tro tan trong nước
Bảng 3.20. Tro tan trong nước của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tro không tan trong acid (%) 5,581 5,719 5,915 5,73 3.4.7. pH
Bảng 3.21. pH của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
pH 4,62 4,57 4,61 4,6
3.4.8. Kim loại nặng (Pb)
Bảng 3.22. Giới hạn kim loại nặng cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3
Giới hạn kim loại nặng (Pb) < 20 ppm < 20 ppm < 20 ppm
3.4.9. Định tính
Bằng phản ứng hóa học
Thuốc thử Kết quả
NaOH 10% Màu vàng sáng (+)
FeCl3 5% Màu xanh dương (+)
Mg + HClđđ Màu đỏ (+)
Kết luận: cao Diếp cá cho phản ứng dương tính với các phản ứng định tính.
Bằng SKLM
Kết quả:
C: dung dịch chuẩn T: dung dịch thử
Hình chụp khi phun TT FeCl3 5% Hình chụp dưới UV 254 nm
Hình 3.8. SKLM của cao Diếp cá
Kết luận: sắc ký đồ của dung dịch thử của cao Rau má có chứa vết có Rf và màu sắc tương ứng với vết quercetin chuẩn.
3.4.10. Định lượng
Tiến hành: cân khoảng 1g cao, chiết lấy cắn chlorohorm theo Sơ đồ 2.2, chuẩn bị dung dịch thử như mục 2.2.5.2, ta có kết quả định lượng Bảng 3.24.
Bảng 3.24. Kết quả định lượng quercetin trong cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Hình 3.9. Sắc ký đồ của quercetin chuẩn và thử
3.5. ĐỀ XUẤT TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO DIẾP CÁ
Dựa trên kết quả kiểm nghiệm cao Diếp cá, chúng tôi đề ra tiêu chuẩn như sau :
Bảng 3.25. Đề xuất tiêu chuẩn và kết quả kiểm nghiệm cao Diếp cá
STT Chỉ tiêu Yêu cầu chất lượng Kết quả
1 Hình thức cảm quan Bột nửa mịn, màu nâu sẫm, mùi đặc
trưng, rất dễ hút ẩm Đạt
2 Độ tan trong nước Cao khó tan trong nước Đạt
Cao khó tan trong cồn cao độ (70-96%)
4 Độ ẩm Không quá 10% Đạt (5,667%)
5 Độ tro
- Tro toàn phần
- Tro không tan/acid HCl - Tro tan trong nước
- Không quá 20% - Không quá 1% - Không quá 10% - Đạt (17,73%) - Đạt (0,55%) - Đạt (5,73%) 6 pH 4-6 Đạt (4,6)
7 Kim loại nặng (Pb) Không quá 20 ppm Đạt
8 Định tính - NaOH 10% - FeCl3 5% - Mg + HClđđ - SKLM - Màu vàng sáng (+) - Màu xanh dương(+) - Màu đỏ (+)
- Dung dịch thử có vết Rf và màu sắc tương ứng với vết quercetin chuẩn
Đúng
lượng qua các giai đoạn: từ kiểm nghiệm dược liệu, xây dựng quy trình định lượng đến việc xác định mối liên hệ nhân quả, tối ưu hóa, thực nghiệm kiểm chứng và đề xuất phương pháp kiểm nghiệm cao.
Giai đoạn kiểm nghiệm dược liệu và đề xuất phương pháp kiểm nghiệm cao Diếp cá được thực hiện dựa trên cơ sở các kết quả thực nghiệm và tham khảo các tiêu chuẩn hiện có của các cao, các dược liệu khác theo Dược điển Việt Nam III và các tài liệu tham khảo.
Quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá bằng phương pháp HPLC đã được xây dựng và thẩm định trên việc khảo sát tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Kết quả cho thấy quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC có tính chính xác và độ tin cậy cao. Điều này thể hiện trên tính tương thích hệ thống rất tốt, tính tuyến tính trong các khoảng nồng độ phù hợp có R2 > 0,99, độ chính xác cao với RSD = 2,8% dựa theo nồng độ khảo sát và độ đúng đạt với các tỷ lệ phục hồi trung bình nằm trong khoảng từ 98 đến 102%.
Phần mềm thông minh FormRules đã giúp khảo sát xu hướng, mức độ và quy luật liên quan nhân quả, giúp hiểu rõ các biến độc lập x (nhân) nào ảnh hưởng đến biến phụ thuộc y (quả) và nếu có ảnh hưởng thì ảnh hưởng theo quy luật nào.
Kết quả từ phần mềm FormRules cho thấy:
- Hiệu suất chiết của cao Diếp cá thì chịu ảnh hưởng bởi 3 yếu tố độ cồn, tỷ lệ dược liệu/dung môi, số lần chiết.
- Hàm lượng quercetin trong cao Diếp cá chịu ảnh hưởng chủ yếu bởi độ cồn, tỷ lệ dược liệu/dung môi, số lần chiết.
Phần mềm INForm đã giúp tối ưu hóa thông số của quy trình chiết xuất cao Diếp cá. Kết quả tối ưu đã được kiểm chứng lại bằng thực nghiệm cho thấy các giá trị
Như vậy, quy trình chiết xuất cao Diếp cá với hiệu suất chiết tối đa, hàm lượng hoạt chất cao nhất đã được xây dựng thành công nhờ sự hỗ trợ của các phần mềm Design-Expert, FormRules và INForm. Việc kết hợp phương pháp truyền thống với sự hỗ trợ của các phần mềm thông minh đã giúp giảm chi phí, công sức và thời gian trong giai đoạn nghiên cứu.
Kiểm nghiệm cao Diếp cá đã được xây dựng và đề xuất các chỉ tiêu chất lượng phù hợp cho một cao chiết đi từ dược liệu. Đặc biệt, trong đề tài này đã hoàn thiện được các quy trình định lượng hoạt chất chính có trong dược liệu bằng phương pháp HPLC đã được thẩm định, nâng cao mức chất lượng cho cao Diếp cá.
Trong đề tài luận văn này, chúng tôi đã thực hiện được các công việc sau:
- Kiểm nghiệm dược liệu Diếp cá ở các chỉ tiêu sau: cảm quan, soi bột, độ ẩm, độ tro, tạp chất, định tính, định lượng tinh dầu. Tất cả các chỉ tiêu đều đạt và đúng, trừ phần định lượng hàm lượng tinh dầu trong Diếp cá là chưa đạt (0,05% < 0,08% theo yêu cầu).
- Xây dựng phương pháp định lượng quercetin trong cao Diếp cá bằng phương pháp HPLC. Quy trình định lượng đã được thẩm định về tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, chứng tỏ quy trình có tính chính xác và độ tin cậy cao.
- Dùng mô hình D-Optimal với 3 biến số độc lập: độ cồn, tỷ lệ dược liệu/dung môi, số lần chiết, tiến hành trên 14 thí nghiệm thay đổi các biến số trên. Việc tối ưu trong chiết xuất cao Diếp cá dựa vào hoạt chất hoặc chất đánh dấu tương ứng là quercetin. Kết quả xác định được các thông số tối ưu như sau:
+ Độ cồn: B
+ Tỷ lệ dược liệu/dung môi: 1/8
+ Số lần chiết: 2 lần
- Xây dựng hoàn chỉnh quy trình chiết xuất cao Diếp cá ở quy mô phòng thí nghiệm theo các thông số đã được tối ưu để chiết xuất cao đạt tiêu chuẩn chất lượng tốt. - Kiểm nghiệm cao Diếp cá ở các chỉ tiêu: cảm quan, độ tan trong nước, độ tan trong cồn, độ ẩm, độ tro, pH, giới hạn kim loại nặng, định tính, định lượng. Từ đó xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao Diếp cá.
Quy trình chiết xuất cao Diếp cá vừa được xây dựng dự kiến sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu sau này trên các quy mô pilot và công nghiệp.
sót cần phải khắc phục. Tuy nhiên do điều kiện và thời gian thực hiện đề tài có giới hạn, chúng tôi xin được đề nghị như sau:
- Nâng cấp quy trình chiết xuất cao Diếp cá ở quy mô pilot và quy mô công nghiệp. - Kiểm tra và xây dựng chỉ tiêu giới hạn nhiễm khuẩn, dư lượng thuốc trừ sâu cho cao Diếp cá.
- Theo dõi độ ổn định của cao Diếp cá.
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao Diếp cá.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ môn Dược liệu Đại học Y Dược TPHCM (2008), Giáo trình Phương pháp nghiên cứu dược liệu, tr.105-118, 139-141.
2. Bộ môn Dược liệu Đại học Y Dược TPHCM- Bộ môn Dược liệu Đại học Dược Hà Nội (1998), Bài giảng Dược liệu-tập 1, Bộ Y tế và Bộ Giáo dục đào tạo, tr.259-289.
3. Bộ môn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm Đại học Y Dược TPHCM (2008-2009),
Giáo trình lý thuyết Kiểm nghiệm thuốc, tr.58-60, 87-118.
4. Đặng Văn Giáp. Thiết kế & tối ưu hóa công thức và quy trình. Nhà xuất bản Y học (2002).
5. Bộ môn Thực vật Đại học Y Dược TPHCM (2005), Giáo trình Phân loại thực vật, tr.51.
6. Bộ Y tế (2002), Dược Điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y Học, tr.350.
7. Bộ Y tế-Vụ Khoa học và Đào tạo (2007), Bào chế và sinh dược học-tập 1, Nhà xuất bản Y Học, tr.221-223, 230-232, 247-252.
8. Đại học Y Dược TPHCM (2009), “Xây dựng quy trình định lượng flavonoid toàn phần trong cao Bạch quả, viên bao phim O.P.Can và quercetin trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC”, Y học TPHCM-Chuyên đề Dược, 13 (1), tr.78-83.
9. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, tr.40-41.
10. Hoàng Thanh Hương, Trần Quỳnh Hoa, Hà Việt Bảo, Nguyễn Danh Thục (2002), ‘‘Góp phần nghiên cứu thành phần flavonoid chiết xuất từ lá cây Diếp cá Houttuynia cordata Thunb. của Việt Nam’’, Tạp chí Dược học, Nhà xuất bản Bộ y tế, Hà Nội, 9, tr.13-15.
học Y Dược TPHCM.
12. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam-quyển 1, Nhà xuất bản Trẻ, tr.288.
13. Phạm Xuân Sinh, Cao Văn Thu, Đinh Thị Thanh Thủy (1997), ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học cây Diếp cá’’, Tạp chí Dược học, Nhà xuất bản Bộ y tế, Hà Nội, 7, tr.7-9.
14. Trần Việt Hưng (1998), Thuốc nam trên đất Mỹ-tập 1, Nhà xuất bản HK publishing Co.
15. Võ Văn Chi (2004), Tự điển thực vật thông dụng-tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tr. 1386-1387.
16. Nguyễn Thị Ngọc Phượng, (2009), Tiêu chuẩn hóa bột cao Diếp cá, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học, Đại học Y Dược TPHCM.
TIẾNG NƯỚC NGOÀI
17. Chiang L. C., Chang J. S., Chen C. C., Liu L. T., Wang K. C., Lin C. C. (2001), “Antileukemic activity of Bidens pilosa L. var. minor (blume) Sherff and Houttuynia cordata Thunb.”, Am. J. Chin. Med. , 29 (2), pp.303-312. 18. Chiang Y. Y., Chang J. S., Chen C. C., Ng L. T., Lin C. C. (2003), ‘‘Anti –
herpes simplex virus activity of Bidens pilosa and Houttuynia cordata’’, Am J. Chin Med., 31 (3), pp.355-362.
19. Cho E. J., Yokozawa T., Rhyu D. Y., Kim H. Y. , Shibahara N., Park J. C. (2003), “The inhibitory effects of 12 medicinal plants and their compoment compound on lipid peroxidation”, Am. J. Chin. Med. , 31 (6), pp.907-917. 20. Cho E. J., Yokozawa T., Rhyu D. Y., Kim S. C., Shibahara N., and Park J.
C. (2003), “Study on the inhibitory effects of korean medicinal plants and their main compounds on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical”,
in Sacramento, California’’, Int. J. Food Sci. Nutr. , 53 (2), pp.117-128.
22. Cowan M. M. (1999), ‘‘Plant products as antimicrobial agents’’, Clinical Microbiology Reviews, 12 (4), pp.569.
23. Kim I. S., Kim J. H., Yun C. Y., Kim D. H., Lee J. S. (2007), “The inhibitory effect of Houtuynia cordata extract on stem cell factor-induced HMC-1 cell migration”, J. Ethnopharmacol, 112 (1), pp.90-95.
24. Kim S. K., Ryu S. Y., No J., Choi S. U., Kim Y. S. (2001), “Cytotoxic alkaloids from Houttuynia cordata”, Arch. Pharm. Res. , 24 (6), pp.518-521. 25. Li C., Zhao Y., Liang C., An H. (2001), ‘‘Observations of the curative effect
with various liquid for post operative irrigation of ESS of treating chronic sinusitis and nasal polyps’’, Lin Chuang Er bi yan Hou Ke Za Zhi, 15 (2), pp.53-54.
26. Liang M. M., Qi M. L., Fu R. N. (2005), ‘‘Flash evaporation and headspace solid-phase microextraction for the analysis of the essential oils in traditional Chinese medicine, Houttuynia cordata Thunb.’’, Chinese Chemical Letters, 16 (5), pp.659-662.
27. Liang M., Qi M., Zhang C., Zhou S., Fu R., Huang J. (2005), ‘‘Gas chromatography-mass spectrometry analysis of volatile compounds from
Houttuynia cordata Thunb. after extraction by solid-phase microextraction, flash evaporation and steam distillation’’, Analytica Chimica Acta, 531, pp.97-104.
28. Lu H., Wu X., Liang Y., Zhang J. (2006), ‘‘Variation in chemical composition and antibacterial activities of essential oils from two species of
Houttuynia Thunb.’’, Chem. Pharm. Bull. , 54 (7), pp.936-940.
29. Lu H. M., Liang Y. Z., Yi L. Z., Wu X. J. (2006), ‘‘Anti-inflammatory