2.2.1. Xử lý nguyên liệu
Dược liệu Diếp cá khô được xay và xử lý để có kích thước 2 - 6 mm, bảo quản nơi khô thoáng.
Chất chuẩn đối chiếu quercetin được bảo quản trong tủ lạnh 2-8oC.
2.2.2. Kiểm nghiệm dược liệu
Dược liệu Diếp cá phải được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn quy định trong DĐVN III trang 350 về các chỉ tiêu: mô tả, vi phẫu, soi bột, định tính, độ ẩm, tro toàn phần, tạp chất, tỷ lệ vụn nát, định lượng.
2.2.3. Quy trình chiết xuất cao Diếp cá
Diếp cá
Dịch chiết cồn
Cao Diếp cá
Đun hồi lưu với cồn
Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết xuất cao Diếp cá
Cân khoảng 150 g dược liệu Diếp cá đã được kiểm nghiệm các chỉ tiêu như mục
2.2.2, cho vào erlen 2000 ml, đun hồi lưu với cồn ở nhiệt độ khoảng 70oC. Gộp các dịch chiết lọc qua bông thu dịch lọc, đem dịch lọc sấy phun sương thu được cao. Khối lượng dược liệu: 150 g.
Kích thước dược liệu: 2 - 6 mm. Phương pháp chiết: đun hồi lưu. Nhiệt độ chiết: 70oC.
Thời gian 1 lần chiết: 2h. Dung môi chiết: cồn. Độ cồn: A, B, C.
Tỉ lệ dược liệu:dung môi: 1/8, 1/9, 1/10. Số lần chiết: 2 lần, 3 lần.
2.2.4. Quy trình chiết xuất cắn CHCl3 từ cao Diếp cá để định lượng quercetin
Đặt vấn đề Dương Huỳnh Điểm
Cao Diếp cá
Dịch H2O
Dịch thủy phân
Dịch CHCl3
Hòa tan vào H2O
Lắc với CHCl3, gạn bỏ lớp CHCl3
HCl 10%/ EtOH Thủy phân 3h
Lắc với H2O, gạn bỏ lớp nước Lắc với CHCl3 (3 lần)
Sơ đồ 2.2. Quy trình xử lý mẫu để định lượng quercetin/cao Diếp cá
Cân chính xác khoảng 1 g cao Diếp cá, hòa tan với 5 ml nước nóng, thêm vào 20 ml chloroform, siêu âm 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml HCl 10%/cồn đun hồi lưu 3h. Dịch thủy phân sau đó siêu âm với 15 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 15 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại thêm 2 lần nữa. Gộp dịch chloroform của 3 lần siêu âm với 20 ml nước. Rút dịch chloroform đem cô đến cắn.
2.2.5. Phương pháp HPLC định lượng quercetin trong cao Diếp cá
2.2.5.1. Điều kiện HPLC định lượng quercetin Cột sắc ký: X.Terra RP18, 250 x 4,6 mm, 5 µm. Pha động: CH3CN-H2O (55:45).
Detector: UV-Vis. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước sóng phát hiện: 370 nm. Tốc độ dòng: 0,85 ml/phút. Thể tích bơm: 30 µl.
Nhiệt độ cột: 25 – 30oC.
2.2.5.2. Cách pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử
Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 1 mg chuẩn đối chiếu quercetin cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan với methanol, siêu âm và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khoảng 100 µg/ml.
Dung dịch thử nghiệm: cân chính xác khoảng 10 mg cắn chloroform cho vào bình định mức 5 ml, hòa tan với methanol, siêu âm và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch thử có nồng độ khoảng 2000 µg/ml. 2.2.5.3. Thẩm định quy trình phân tích [3]
Khảo sát tính tương thích hệ thống
Bơm 6 lần dung dịch thử. Khảo sát các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh. Xử lý thống kê số liệu các giá trị sau:
- Giá trị trung bình - Độ lệch chuẩn
- Độ lệch chuẩn tương đối
Khảo sát tính tuyến tính
Khảo sát sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của quercetin trong cao Diếp cá: pha các dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau, bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao và ghi nhận các diện tích đỉnh. Từ đó, thiết lập phương trình hồi quy yˆ = Bx + Bo.
Tính thích hợp của phương trình yˆ= f(x) được đánh giá bằng trắc nghiệm F. Ý nghĩa của các hệ số B và Bo được kiểm tra đánh giá bằng trắc nghiệm t.
Tiến hành lặp lại 6 lần quy trình chiết và định lượng trên cùng một mẫu cao và ghi nhận kết quả. Tiến hành xử lý thống kê, xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
Khảo sát độ đúng
Thêm lượng chất chuẩn quercetin tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng quercetin có trong mẫu thử. Bơm vào hệ thống HPLC và ghi nhận diện tích đỉnh ở bước sóng phù hợp. Xác định tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ thêm vào, tính tỷ lệ hồi phục trung bình.
2.2.6. Thiết lập và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao Diếp cá
Thiết lập mô hình thực nghiệm: mô hình thực nghiệm được thiết kế bởi phần
mềm Design-Expert gồm 14 quy trình chiết xuất được trình bày trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Mô hình D-Optimal Thí nghiệm x1 x2 x3 1 C 1/8 3 2 B 1/10 2 3 C 1/10 2 4 B 1/8 2 5 A 1/10 2 6 A 1/10 3 7 C 1/9 3 8 A 1/8 3 9 A 1/8 2 10 B 1/9 3
11 C 1/10 3 12 B 1/9 2 13 A 1/9 3 14 C 1/9 3 Biến độc lập: x1 = độ cồn (A, B, C) x2 = tỷ lệ DL/DM (1/8, 1/9, 1/10) x3 = số lần chiết (2 lần, 3 lần) Biến phụ thuộc:
y1 = hiệu suất chiết cao (%)
y2 = hàm lượng quercetin trong cao Diếp cá (%)
Quy trình chiết xuất
Thông số độ cồn, tỷ lệ DL/DM, số lần chiết thay đổi theo thiết kế, những thông số khác của quy trình được giữ cố định.
Phân tích dữ liệu
Phần mềm thông minh FormRules được sử dụng để nghiên cứu liên quan nhân quả. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất được thực hiện bởi phần mềm thông minh INForm.
Thực nghiệm kiểm chứng
Thông số quy trình chiết xuất tối ưu được áp dụng để tiến hành 2 thực nghiệm kiểm chứng và so sánh với kết quả dự đoán.
2.2.7. Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm cao Diếp cá
2.2.7.1. Hình thức cảm quan (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 1.1, trang PL-9. 2.2.7.2. Độ tan trong nước
Cân khoảng 1 g bột cao Diếp cá cho vào becher 250 ml. Thêm vào 100 ml nước cất. Khuấy thật kĩ cho tan. Để yên 15 phút và quan sát.
Nếu dung dịch đồng nhất: cao hơi tan trong nước.
Nếu dung dịch không đồng nhất: cao khó tan hoặc không tan trong nước. 2.2.7.3. Độ tan trong cồn
Cân khoảng 1 g bột cao Diếp cá cho vào becher 50 ml. Thêm vào 30 ml dung dịch cồn có độ cồn xác định. Khuấy thật kĩ cho tan. Để yên 15 phút và quan sát.
Nếu dung dịch đồng nhất: cao tan trong cồn có độ cồn xác định.
Nếu dung dịch không đồng nhất: cao khó tan hoặc không tan trong cồn có độ cồn xác định. Thử nghiệm với các dung dịch cồn có độ cồn thay đổi từ 10-96%.
2.2.7.4. Cắn không tan trong nước
Tiến hành: cân khoảng 1 g cao, hòa trong 50 ml nước cất trong cốc có mỏ. Lọc qua giấy lọc đã cân bì trước, sấy khô ở 100oC, để nguội 1 giờ trong bình hút ẩm. Cân, tính phần trăm cắn không tan trong nước so với khối lượng cao.
2.2.7.5. Độ ẩm
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 9.6, trang PL-143. 2.2.7.6. Độ tro
Tro toàn phần
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 7.6, trang PL-129, phương pháp 2.
Tro không tan trong acid
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 7.5, trang PL-128.
Tro tan trong nước
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 7.8, trang PL-129. 2.2.7.7. pH
Cân khoảng 1 g bột cao Diếp cá, hòa trong 200 ml nước cất đun sôi để nguội. Lọc, lấy dịch lọc, dùng dịch lọc để đo pH.
2.2.7.8. Kim loại nặng
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 7.4.7, trang PL-126. 2.2.7.9. Định tính
Bằng phản ứng hóa học
Lấy khoảng 0,5 g bột cao Diếp cá, hòa trong 20 ml cồn 96%, đun nhẹ trên cách thủy cho tan, lọc và lấy dịch lọc chia ra 3 ống nghiệm và làm các phản ứng:
- Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: nhỏ vài giọt thuốc thử NaOH 10% sẽ thấy dung dịch thử chuyển sang màu vàng sáng.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: nhỏ vài giọt thuốc thử FeCl3 5% sẽ thấy dung dịch thử chuyển sang màu xanh dương.
- Phản ứng cyanidin (bột Mg kim loại + HClđđ, đun nóng): thêm vào dung dịch thử ít bột Mg và 3 giọt HClđđ, đun nóng trên cách thủy sẽ xuất hiện màu đỏ.
Bằng SKLM: đối chiếu với quercetin chuẩn
Bản mỏng: silica gel 60 F254 (Merck).
Hệ dung môi: toluene-chloroform-acetone (8:5:7).
Phát hiện: soi UV ở bước sóng 254 nm và phun dung dịch FeCl3 5% trong methanol. Tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 20 µl mỗi dung dịch sau:
- Dung dịch chuẩn: lấy một ít tinh thể quercetin cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt methanol để hòa tan. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dung dịch thử: chiết 1 g cao Diếp cá với 20 ml CHCl3 bằng siêu âm. Lọc, cô cách thủy làm đậm đặc dịch chiết.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử như đã mô tả trong mục 2.2.5.2. Tiêm lần lượt các mẫu dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống HPLC, xác định diện tích đỉnh quercetin, rồi tính toán hàm lượng quercetin trong cao Diếp cá.
Hàm lượng phần trăm quercetin trong cao Diếp cá được tính theo công thức: 2 1 . . .100. % .100 . . .(100 ) c t t c C S m HLC X C S m a = −
Cc, Ct (µg/ ml): nồng độ pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử Sc, St: diện tích đỉnh dung dịch chuẩn và dung dịch thử
m1 (g): khối lượng cao đem xử lý để được cắn chloroform. m2 (g): khối lượng cắn chloroform thu được
HLC: hàm lượng chuẩn đối chiếu quercetin a (%): độ ẩm
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU DIẾP CÁ3.1.1. Mô tả 3.1.1. Mô tả
Thân hình trụ tròn hay dẹt, cong, dài 20-35 cm, đường kính 2-3 mm, mặt ngoài màu vàng nâu nhạt. Lá mọc so le hình tim, đầu lá nhọn, phiến lá gấp cuộn lại, nhàu nát, cuống lá dài chừng 2-3 cm, gốc cuống rộng thành bẹ mỏng. Mùi tanh cá. Vị hơi chát, se.
3.1.2. Vi phẫu
Biểu bì trên và dưới của lá gồm một lớp tế bào hình chữ nhật, xếp đều đặn, mang lông tiết đầu đơn bào chân đa bào và lông che chở đa bào có xen lẫn tế bào tiết màu vàng ở mặt trên gân lá. Ở mặt dưới phiến lá có lỗ khí. Mô mềm có tế bào màng mỏng và ít khuyết nhỏ. Bó libe – gỗ ở giữa gân lá gồm có bó gỗ ở trên, bó libe ở dưới. Mô mềm phiến lá có những khuyết nhỏ và bó libe – gỗ nhỏ.
Bó libe-gỗ Lông che chở Lỗ khí
Hình 3.1. Vi phẫu lá Diếp cá
3.1.3. Soi bột
Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm tế bào hình nhiều cạnh, thành hơi dày, mang tế bào tiết. Biểu bì dưới có lỗ khí. Tế bào tiết tròn, chứa tinh dầu màu vàng nhạt hay vàng nâu. Lỗ khí có 4 – 5 tế bào kèm nhỏ hơn. Lông che chở đa bào và tế bào tiết. Mảnh mạch xoắn. Giọt tinh dầu.
Tế bào tiết chứa tinh dầu Mạch xoắn Mạch mạng
Hình 3.2. Soi bột Diếp cá
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III
3.1.4. Định tính
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại
Bột và thân lá phát huỳnh quang màu nâu hung.
Phản ứng hóa học
Bảng 3.1. Định tính dược liệu Diếp cá
Phản ứng Thuốc thử Kết quả
A TT Bouchardat Tủa đỏ nâu (+)
B Quan sát ánh sáng tử ngoại Phát quang màu nâu hung (+) C dd acid fuchsin sulfureux Bột ướt có màu hồng tím (+)
D Bột Mg + HClđđ Màu đỏ (+)
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.5. Độ ẩm
Bảng 3.2. Độ ẩm dược liệu Diếp cá (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Độ ẩm (%) 10,83 11,14 11,19 11,05
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.6. Tro toàn phần
Yêu cầu: không quá 14%.
Bảng 3.3. Tro toàn phần dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tro toàn phần (%) 11,54 10,77 11,25 11,18
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.7. Tạp chất
Yêu cầu: không quá 2%.
Bảng 3.4. Tạp chất dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tạp chất (%) 1,54 1,39 1,49 1,47
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.8. Tỷ lệ vụn nát
Yêu cầu: không quá 5%
Bảng 3.5. Tỷ lệ vụn nát dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.9. Định lượng tinh dầu
Yêu cầu: hàm lượng tinh dầu không ít hơn 0,08%
Bảng 3.6. Hàm lượng tinh dầu dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Hàm lượng tinh dầu (%) 0,05 0,04 0,05 0,05
Kết luận: không đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
Như vậy, dược liệu Diếp cá đạt yêu cầu tất cả các chỉ tiêu trong chuyên luận dược liệu Diếp cá DĐVN III, trừ định lượng tinh dầu là 0,05%.
3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG QUERCETIN TRONG CAO DIẾP CÁ TRONG CAO DIẾP CÁ
3.2.1. Quy trình chiết xuất cắn CHCl3 từ cao Diếp cá để định lượng quercetin
Sau khi thực hiện quy trình xử lý mẫu để định lượng quercetin trong cao Diếp cá theo Sơ đồ 2.2, các dịch chiết CHCl3 được tiến hành chấm SKLM, thu được kết quả theo Hình 3.3. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hệ dung môi:
toluene-chloroform-aceton (8:5:7) Vết chấm: C: quercetin chuẩn 1: Dịch chiết CHCl3 lần 1 2: Dịch chiết CHCl3 lần 2 3: Dịch chiết CHCl3 lần 3
Hình chụp khi phun
TT FeCl3 5% Hình chụp dưới UV 254 nm
Hình 3.3. SKLM dịch chiết quercetin bằng CHCl3
Kết quả: đã chiết kiệt quercetin sau 3 lần chiết với CHCl3.
3.2.2. Thẩm định quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá
3.2.2.1. Tính tương thích hệ thống
Kết quả thực nghiệm để đánh giá tính tương thích hệ thống của phương pháp HPLC định lượng quercetin trong cao Diếp cá được trình bày trong Bảng 3.7 và Bảng 3.8.
Bảng 3.7. Các thông số sắc ký của mẫu quercetin chuẩn
STT Thời gian lưu (tR) Diện tích đỉnh (S) Số đĩa lý thuyết (N)
1 5,925 8867983 2818 2 5,934 8962815 2867 3 5,94 8682189 2894 4 5,945 8787139 2905 5 5,937 8794014 2852 6 5,933 8767535 2829 TB 5,936 8810279,167 2860,833 SD 0,007 95531,241 34,684 RSD% 0,115 1,084 1,212
Bảng 3.8. Các thông số sắc ký của mẫu thử
STT Thời gian lưu (tR) Diện tích đỉnh (S) Số đĩa lý thuyết (N)
1 6,002 5583529 2258 2 6,015 5526160 2169 3 6,028 5493543 2193 4 6,02 5408291 2170 5 6,017 5469011 2215 6 5,97 5431377 2180 TB 6,009 5485318,5 2197,500
SD 0,021 64015,355 34,239
RSD % 0,345 1,167 1,558
Nhận xét: phương pháp HPLC đạt tính tương thích hệ thống. 3.2.2.2. Khảo sát tính tuyến tính
Kết quả khảo sát tính tuyến tính: đường chuẩn được xây dựng với 7 mẫu dung dịch chuẩn quercetin có nồng độ tăng dần từ 25 – 300 µg/ml được trình bày trong
Bảng 3.9 và Hình 3.4.
Bảng 3.9. Sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh
Mẫu chuẩn Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh
1 25 1235715 2 50 2657374 3 100 7810423 4 150 10862974 5 200 15007778 6 250 19615993 7 300 23150992
Hình 3.3. Sự liên quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh
Nhận xét: có sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh của quercetin theo phương trình y = 80700x – 915890, R2 = 0,9977
Xử lý kết quả bằng phần mềm Ms-Excel với công cụ Regression Biện luận:
F = 2131,586 > F0,05 = 5,99: phương trình hồi quy tương thích Hệ số Bo = - 915890
to = - 2,9 < t0,05 = 2,447: hệ số Bo không có ý nghĩa thống kê Hệ số B = 80700
t = 46,169 > t0,05 = 2,447: hệ số B có ý nghĩa thống kê
Kết luận: có sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh của quercetin trong khoảng 25-350 µg/ml, theo phương trình y = 80700x. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.2.3. Khảo sát độ lặp lại
Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày trong Bảng 3.10.
Bảng 3.10. Độ lặp lại của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Mẫu Diện tích đỉnh Hàm lượng quercetin trong cao Diếp cá (%)
1 5583529 0,269 2 5526160 0,287 3 5493543 0,266 4 5408291 0,279 5 5469011 0,274 6 5431377 0,280
TB 0,276
SD 0,008
RSD% 2,801
Kết luận: RSD% = 2,801%, nên phương pháp định lượng quercetin bằng HPLC đạt yêu cầu về độ độ lặp lại.
3.2.2.4. Khảo sát độ đúng