2.2.5.1. Điều kiện HPLC định lượng quercetin Cột sắc ký: X.Terra RP18, 250 x 4,6 mm, 5 µm. Pha động: CH3CN-H2O (55:45).
Detector: UV-Vis.
Bước sóng phát hiện: 370 nm. Tốc độ dòng: 0,85 ml/phút. Thể tích bơm: 30 µl.
Nhiệt độ cột: 25 – 30oC.
2.2.5.2. Cách pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử
Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 1 mg chuẩn đối chiếu quercetin cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan với methanol, siêu âm và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khoảng 100 µg/ml.
Dung dịch thử nghiệm: cân chính xác khoảng 10 mg cắn chloroform cho vào bình định mức 5 ml, hòa tan với methanol, siêu âm và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch thử có nồng độ khoảng 2000 µg/ml. 2.2.5.3. Thẩm định quy trình phân tích [3]
Khảo sát tính tương thích hệ thống
Bơm 6 lần dung dịch thử. Khảo sát các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh. Xử lý thống kê số liệu các giá trị sau:
- Giá trị trung bình - Độ lệch chuẩn
- Độ lệch chuẩn tương đối
Khảo sát tính tuyến tính
Khảo sát sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của quercetin trong cao Diếp cá: pha các dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau, bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao và ghi nhận các diện tích đỉnh. Từ đó, thiết lập phương trình hồi quy yˆ = Bx + Bo.
Tính thích hợp của phương trình yˆ= f(x) được đánh giá bằng trắc nghiệm F. Ý nghĩa của các hệ số B và Bo được kiểm tra đánh giá bằng trắc nghiệm t.
Tiến hành lặp lại 6 lần quy trình chiết và định lượng trên cùng một mẫu cao và ghi nhận kết quả. Tiến hành xử lý thống kê, xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
Khảo sát độ đúng
Thêm lượng chất chuẩn quercetin tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng quercetin có trong mẫu thử. Bơm vào hệ thống HPLC và ghi nhận diện tích đỉnh ở bước sóng phù hợp. Xác định tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ thêm vào, tính tỷ lệ hồi phục trung bình.