3.1.1. Mô tả
Thân hình trụ tròn hay dẹt, cong, dài 20-35 cm, đường kính 2-3 mm, mặt ngoài màu vàng nâu nhạt. Lá mọc so le hình tim, đầu lá nhọn, phiến lá gấp cuộn lại, nhàu nát, cuống lá dài chừng 2-3 cm, gốc cuống rộng thành bẹ mỏng. Mùi tanh cá. Vị hơi chát, se.
3.1.2. Vi phẫu
Biểu bì trên và dưới của lá gồm một lớp tế bào hình chữ nhật, xếp đều đặn, mang lông tiết đầu đơn bào chân đa bào và lông che chở đa bào có xen lẫn tế bào tiết màu vàng ở mặt trên gân lá. Ở mặt dưới phiến lá có lỗ khí. Mô mềm có tế bào màng mỏng và ít khuyết nhỏ. Bó libe – gỗ ở giữa gân lá gồm có bó gỗ ở trên, bó libe ở dưới. Mô mềm phiến lá có những khuyết nhỏ và bó libe – gỗ nhỏ.
Bó libe-gỗ Lông che chở Lỗ khí
Hình 3.1. Vi phẫu lá Diếp cá
3.1.3. Soi bột
Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm tế bào hình nhiều cạnh, thành hơi dày, mang tế bào tiết. Biểu bì dưới có lỗ khí. Tế bào tiết tròn, chứa tinh dầu màu vàng nhạt hay vàng nâu. Lỗ khí có 4 – 5 tế bào kèm nhỏ hơn. Lông che chở đa bào và tế bào tiết. Mảnh mạch xoắn. Giọt tinh dầu.
Tế bào tiết chứa tinh dầu Mạch xoắn Mạch mạng
Hình 3.2. Soi bột Diếp cá
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III
3.1.4. Định tính
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại
Bột và thân lá phát huỳnh quang màu nâu hung.
Phản ứng hóa học
Bảng 3.1. Định tính dược liệu Diếp cá
Phản ứng Thuốc thử Kết quả
A TT Bouchardat Tủa đỏ nâu (+)
B Quan sát ánh sáng tử ngoại Phát quang màu nâu hung (+) C dd acid fuchsin sulfureux Bột ướt có màu hồng tím (+)
D Bột Mg + HClđđ Màu đỏ (+)
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.5. Độ ẩm
Bảng 3.2. Độ ẩm dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Độ ẩm (%) 10,83 11,14 11,19 11,05
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.6. Tro toàn phần
Yêu cầu: không quá 14%.
Bảng 3.3. Tro toàn phần dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tro toàn phần (%) 11,54 10,77 11,25 11,18 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.7. Tạp chất
Yêu cầu: không quá 2%.
Bảng 3.4. Tạp chất dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tạp chất (%) 1,54 1,39 1,49 1,47
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.8. Tỷ lệ vụn nát
Yêu cầu: không quá 5%
Bảng 3.5. Tỷ lệ vụn nát dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.9. Định lượng tinh dầu
Yêu cầu: hàm lượng tinh dầu không ít hơn 0,08%
Bảng 3.6. Hàm lượng tinh dầu dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Hàm lượng tinh dầu (%) 0,05 0,04 0,05 0,05
Kết luận: không đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
Như vậy, dược liệu Diếp cá đạt yêu cầu tất cả các chỉ tiêu trong chuyên luận dược liệu Diếp cá DĐVN III, trừ định lượng tinh dầu là 0,05%.
3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG QUERCETIN TRONG CAO DIẾP CÁ TRONG CAO DIẾP CÁ
3.2.1. Quy trình chiết xuất cắn CHCl3 từ cao Diếp cá để định lượng quercetin
Sau khi thực hiện quy trình xử lý mẫu để định lượng quercetin trong cao Diếp cá theo Sơ đồ 2.2, các dịch chiết CHCl3 được tiến hành chấm SKLM, thu được kết quả theo Hình 3.3.
Hệ dung môi:
toluene-chloroform-aceton (8:5:7) Vết chấm: C: quercetin chuẩn 1: Dịch chiết CHCl3 lần 1 2: Dịch chiết CHCl3 lần 2 3: Dịch chiết CHCl3 lần 3
Hình chụp khi phun
TT FeCl3 5% Hình chụp dưới UV 254 nm
Hình 3.3. SKLM dịch chiết quercetin bằng CHCl3
Kết quả: đã chiết kiệt quercetin sau 3 lần chiết với CHCl3.
3.2.2. Thẩm định quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá
3.2.2.1. Tính tương thích hệ thống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả thực nghiệm để đánh giá tính tương thích hệ thống của phương pháp HPLC định lượng quercetin trong cao Diếp cá được trình bày trong Bảng 3.7 và Bảng 3.8.
Bảng 3.7. Các thông số sắc ký của mẫu quercetin chuẩn
STT Thời gian lưu (tR) Diện tích đỉnh (S) Số đĩa lý thuyết (N)
1 5,925 8867983 2818 2 5,934 8962815 2867 3 5,94 8682189 2894 4 5,945 8787139 2905 5 5,937 8794014 2852 6 5,933 8767535 2829 TB 5,936 8810279,167 2860,833 SD 0,007 95531,241 34,684 RSD% 0,115 1,084 1,212
Bảng 3.8. Các thông số sắc ký của mẫu thử
STT Thời gian lưu (tR) Diện tích đỉnh (S) Số đĩa lý thuyết (N)
1 6,002 5583529 2258 2 6,015 5526160 2169 3 6,028 5493543 2193 4 6,02 5408291 2170 5 6,017 5469011 2215 6 5,97 5431377 2180 TB 6,009 5485318,5 2197,500
SD 0,021 64015,355 34,239
RSD % 0,345 1,167 1,558
Nhận xét: phương pháp HPLC đạt tính tương thích hệ thống. 3.2.2.2. Khảo sát tính tuyến tính
Kết quả khảo sát tính tuyến tính: đường chuẩn được xây dựng với 7 mẫu dung dịch chuẩn quercetin có nồng độ tăng dần từ 25 – 300 µg/ml được trình bày trong
Bảng 3.9 và Hình 3.4.
Bảng 3.9. Sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh
Mẫu chuẩn Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh
1 25 1235715 2 50 2657374 3 100 7810423 4 150 10862974 5 200 15007778 6 250 19615993 7 300 23150992
Hình 3.3. Sự liên quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh
Nhận xét: có sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh của quercetin theo phương trình y = 80700x – 915890, R2 = 0,9977
Xử lý kết quả bằng phần mềm Ms-Excel với công cụ Regression Biện luận:
F = 2131,586 > F0,05 = 5,99: phương trình hồi quy tương thích Hệ số Bo = - 915890
to = - 2,9 < t0,05 = 2,447: hệ số Bo không có ý nghĩa thống kê Hệ số B = 80700
t = 46,169 > t0,05 = 2,447: hệ số B có ý nghĩa thống kê
Kết luận: có sự liên quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh của quercetin trong khoảng 25-350 µg/ml, theo phương trình y = 80700x.
3.2.2.3. Khảo sát độ lặp lại
Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày trong Bảng 3.10.
Bảng 3.10. Độ lặp lại của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Mẫu Diện tích đỉnh Hàm lượng quercetin trong cao Diếp cá (%)
1 5583529 0,269 2 5526160 0,287 3 5493543 0,266 4 5408291 0,279 5 5469011 0,274 6 5431377 0,280
TB 0,276
SD 0,008
RSD% 2,801 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết luận: RSD% = 2,801%, nên phương pháp định lượng quercetin bằng HPLC đạt yêu cầu về độ độ lặp lại.
3.2.2.4. Khảo sát độ đúng
Kết quả thực nghiệm để đánh giá độ đúng được trình bày trong Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Độ đúng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Mẫu Mức khảo sát Lượng thêm vào (mg) Lượng tìm thấy (mg) Tỷ lệ phục hồi (%)
1 80% 0,296 0,311 105,068 2 0,317 0,315 99,369 3 0,303 0,314 103,630 4 100% 0,412 0,427 103,641 5 0,405 0,402 99,259 6 0,418 0,425 101,675 7 120% 0,509 0,502 98,625 8 0,496 0,488 98,387 9 0,504 0,529 104,960 TB 101,62
Nhận xét: tỷ lệ phục hồi trung bình là 101,62% (nằm trong khoảng 98 – 102%), RSD% = 2,72% . Do đó, phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng.
Kết luận: phương pháp đạt yêu cầu về tính tương thích hệ thống, độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng.
3.3. TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIẾP CÁ3.3.1. Liên quan giữa điều kiện chiết xuất và kết quả thực nghiệm 3.3.1. Liên quan giữa điều kiện chiết xuất và kết quả thực nghiệm
Biến độc lập Biến phụ thuộc
x1 = độ cồn x2 = tỷ lệ DL/DM
y1 = hiệu suất chiết cao Diếp cá (%) y2 = hàm lượng quercetin (%)
x3 = số lần chiết
Bảng 3.12. Liên quan giữa điều kiện chiết xuất và kết quả thực nghiệm
x1 x2 x3 y1 y2 1 C 1/8 3 6,466 0,263 2 B 1/10 2 6,788 0,257 3 C 1/10 2 6,725 0,282 4 B 1/8 2 7,531 0,228 5 A 1/10 2 7,076 0,116 6 A 1/10 3 7,745 0,110 7 C 1/9 2 6,240 0,213 8 A 1/8 3 7,999 0,170 9 A 1/8 2 7,878 0,127 10 B 1/9 3 6,562 0,297 11 C 1/10 3 6,674 0,274 12 B 1/9 2 6,238 0,175 13 A 1/9 3 7,381 0,132 14 C 1/9 3 7,301 0,263
3.3.2. Liên quan nhân quả
Với đầu vào là dữ liệu thực nghiệm theo Bảng 3.12, phần mềm thông minh FormRules v3.3 (2007) với tùy chọn Minimum Description Length (MDL) đã phân tích mối liên quan nhân quả như sau:
Bảng 3.13. Liên quan nhân quả trong quy trình chiết xuất cao Diếp cá
x1 x2 x3 R2 luyện
y1 + + + 100
y2 + + + 100
Hiệu suất chiết và hàm lượng quercetin có liên quan trực tiếp với tất cả 3 yếu tố khảo sát là độ cồn, tỷ lệ DL/DM và số lần chiết.
Sự liên quan nhân quả nêu trên theo những qui luật sau đây:
Đối với hiệu suất chiết
Nếu x1 thấp thì y1 sẽ cao (1,00) Nếu x1 cao thì y1 sẽ thấp (0,57)
Hình 3.6. Ảnh hưởng của độ cồn và tỷ lệ DL/DM trên hiệu suất chiết
Đối với hàm lượng quercetin
Nếu x1 thấp thì y2 thấp (0,81) Nếu x1 trung bình thì y2 cao (1,00) Nếu x1 cao thì y2 cao (1,00)
Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ cồn và số lần chiết trên hàm lượng quercetin 3.3.3. Tối ưu hóa thông số
Dữ liệu trong Bảng 3.12 trình bày các yếu tố đầu vào cho phần mềm thông minh INForm. Với nhóm thử gồm 2 mẫu 6 & 11 và thuật toán RPROP, các mô hình liên quan nhân quả được thiết lập và đánh giá về mặt thống kê theo Bảng 3.14. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.14. Đánh giá các mô hình nhân quả đối với cao Diếp cá
Giá trị R2 y1 y2
Nhóm luyện 98,8995% 93,9556%
Nhóm thử 95,2353% 96,2910%
Mô hình y1 có tính tương thích tốt (R2 = 98,8995%) và khả năng dự đoán chính xác (R2 = 95,2353%). Mô hình y2 có tính tương thích tốt (R2 = 93,9556%) và khả năng dự đoán khá chính xác (R2 = 96,2910%). Cả hai mô hình đều có thể được áp dụng trong giai đoạn tối ưu hóa thông số.
Điều kiện tối ưu hóa
x3 = Số lần chiết = số nguyên dương y1 = Hiệu suất = max = Up
y2 = Hàm lượng quercetin = max = Up
Kết quả tối ưu hóa
Thông số tối ưu Tính chất dự đoán
x1 = Độ cồn = B y1 = Hiệu suất = 0,0763
y2 = Hàm lượng quercetin = 0,0027 x2 = Tỷ lệ DL/DM = 1/8
x3 = Số lần chiết = 2
3.3.4. Thực nghiệm kiểm chứng quy trình tối ưu
Nhằm kiểm chứng kết quả của quy trình tối ưu, dược liệu Diếp cá được chiết xuất hai lần với cùng điều kiện và quy trình. Sản phẩm được kiểm tra hiệu suất và kiểm nghiệm hàm lượng quercetin và được so sánh với giá trị dự đoán cho bới phần mềm INForm (Bảng 3.15).
Bảng 3.15. Kết quả thực nghiệm và giá trị dự đoán của dược liệu Diếp cá
Tính chất sản phẩm Thực nghiệm Dự đoán
Lần 1 Lần 2 TB
Hiệu suất (%) 7,050 7,235 7,143 7,63
Hàm lượng quercetin (%) 0,3 0,293 0,297 0,27
Phân tích phương sai hai yếu tố không lặp đối với dữ liệu thực nghiệm cho kết quả F = 0,1975 < F0,05 = 161,44. Vậy quy trình của sản phẩm có tính lặp lại (p > 0,05). Phân tích phương sai hai yếu tố không lặp đối với dữ liệu dự đoán (INForm) với dữ liệu thực nghiệm (trung bình) cho kết quả F = 0,8 < F0,05 = 161,44. Vậy các giá trị dự đoán bởi phần mềm INForm so với giá trị thực nghiệm (trung bình) khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05).
3.4. KIỂM NGHIỆM CAO DIẾP CÁ3.4.1. Hình thức cảm quan 3.4.1. Hình thức cảm quan
Bột nửa mịn, màu nâu sẫm, mùi đặc trưng, rất dễ hút ẩm.
3.4.2. Độ tan trong nước
Kết quả: cao Diếp cá khó tan trong nước.
3.4.3. Độ tan trong cồn
Kết quả: cao Diếp cá tan trong cồn thấp độ (10-60%), khó tan trong cồn cao độ (70-96%).
3.4.4. Cắn không tan trong nước
Bảng 3.16. Cắn không tan trong nước của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cắn không tan trong nước (%) 31,36 32,18 33,98 32,51
3.4.5. Độ ẩm
Bảng 3.17. Độ ẩm của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Độ ẩm (%) 5,545 5,671 5,786 5,67
3.4.6. Độ tro
3.4.6.1. Tro toàn phần
Bảng 3.18. Tro toàn phần của cao Diếp cá
Tro toàn phần (%) 18,38 16,53 18,29 17,73
3.4.6.2. Tro không tan trong acid hydrochlorid
Bảng 3.19. Tro không tan trong acid hydrochlorid của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tro không tan trong acid (%) 0,58 0,52 0,55 0,55
3.4.6.3. Tro tan trong nước
Bảng 3.20. Tro tan trong nước của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tro không tan trong acid (%) 5,581 5,719 5,915 5,73 3.4.7. pH
Bảng 3.21. pH của cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
pH 4,62 4,57 4,61 4,6
3.4.8. Kim loại nặng (Pb)
Bảng 3.22. Giới hạn kim loại nặng cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3
Giới hạn kim loại nặng (Pb) < 20 ppm < 20 ppm < 20 ppm
3.4.9. Định tính
Bằng phản ứng hóa học
Thuốc thử Kết quả
NaOH 10% Màu vàng sáng (+)
FeCl3 5% Màu xanh dương (+)
Mg + HClđđ Màu đỏ (+) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết luận: cao Diếp cá cho phản ứng dương tính với các phản ứng định tính.
Bằng SKLM
Kết quả:
C: dung dịch chuẩn T: dung dịch thử
Hình chụp khi phun TT FeCl3 5% Hình chụp dưới UV 254 nm
Hình 3.8. SKLM của cao Diếp cá
Kết luận: sắc ký đồ của dung dịch thử của cao Rau má có chứa vết có Rf và màu sắc tương ứng với vết quercetin chuẩn.
3.4.10. Định lượng
Tiến hành: cân khoảng 1g cao, chiết lấy cắn chlorohorm theo Sơ đồ 2.2, chuẩn bị dung dịch thử như mục 2.2.5.2, ta có kết quả định lượng Bảng 3.24.
Bảng 3.24. Kết quả định lượng quercetin trong cao Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Hình 3.9. Sắc ký đồ của quercetin chuẩn và thử
3.5. ĐỀ XUẤT TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO DIẾP CÁ
Dựa trên kết quả kiểm nghiệm cao Diếp cá, chúng tôi đề ra tiêu chuẩn như sau :
Bảng 3.25. Đề xuất tiêu chuẩn và kết quả kiểm nghiệm cao Diếp cá
STT Chỉ tiêu Yêu cầu chất lượng Kết quả
1 Hình thức cảm quan Bột nửa mịn, màu nâu sẫm, mùi đặc
trưng, rất dễ hút ẩm Đạt
2 Độ tan trong nước Cao khó tan trong nước Đạt
Cao khó tan trong cồn cao độ (70-96%)
4 Độ ẩm Không quá 10% Đạt (5,667%)
5 Độ tro
- Tro toàn phần
- Tro không tan/acid HCl - Tro tan trong nước
- Không quá 20% - Không quá 1% - Không quá 10% - Đạt (17,73%) - Đạt (0,55%) - Đạt (5,73%) 6 pH 4-6 Đạt (4,6)
7 Kim loại nặng (Pb) Không quá 20 ppm Đạt
8 Định tính - NaOH 10% - FeCl3 5% - Mg + HClđđ - SKLM - Màu vàng sáng (+) - Màu xanh dương(+) - Màu đỏ (+)
- Dung dịch thử có vết Rf và màu sắc tương ứng với vết quercetin chuẩn
Đúng
lượng qua các giai đoạn: từ kiểm nghiệm dược liệu, xây dựng quy trình định lượng đến việc xác định mối liên hệ nhân quả, tối ưu hóa, thực nghiệm kiểm chứng và đề xuất phương pháp kiểm nghiệm cao. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giai đoạn kiểm nghiệm dược liệu và đề xuất phương pháp kiểm nghiệm cao Diếp cá được thực hiện dựa trên cơ sở các kết quả thực nghiệm và tham khảo các tiêu chuẩn hiện có của các cao, các dược liệu khác theo Dược điển Việt Nam III và các tài liệu tham khảo.
Quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá bằng phương pháp HPLC đã được xây dựng và thẩm định trên việc khảo sát tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Kết quả cho thấy quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC có tính chính xác và độ tin cậy cao. Điều này thể hiện trên tính tương thích hệ thống rất tốt, tính tuyến tính trong các khoảng nồng độ phù hợp có R2 > 0,99, độ chính xác cao với RSD = 2,8% dựa theo nồng độ khảo sát và độ đúng đạt với các tỷ lệ phục hồi trung bình nằm trong khoảng từ 98 đến 102%.
Phần mềm thông minh FormRules đã giúp khảo sát xu hướng, mức độ và quy luật liên quan nhân quả, giúp hiểu rõ các biến độc lập x (nhân) nào ảnh hưởng đến biến phụ thuộc y (quả) và nếu có ảnh hưởng thì ảnh hưởng theo quy luật nào.