3.2.1. Khảo sát nồng độ dung dịch NaOH chiết tối ưu
3.2.1.1. Kết quả khảo sát theo mật độ quang
Điều kiện tiến hành:
- Pha các dung dịch NaOH 0,1M; NaOH 0,5M; NaOH 1M; NaOH 1,2M. - Cho vào 4 bình cầu 2 nhánh 500ml sạch 10g hạt điều, đánh số thứ tự, tiếp tục cho lần lƣợt vào mỗi bình 200ml dung môi NaOH ở các nồng độ đã pha.
- Lắp dụng cụ chƣng ninh, một nhánh của bình cầu có nút gắn với nhiệt kế. Tiến hành chƣng ninh trên bếp đun bình cầu ở 900C [7] trong thời gian là 6 giờ.
- Lọc nóng dịch chiết, hút 1ml dịch chiết cho vào bình định mức 50ml, định mức đến vạch bằng nƣớc cất. Đo UV – Vis trong vùng từ 400 nm ÷ 600nm, dung dịch mẫu trống là dung dịch NaOH.
Kết quả đo UV – Vis đƣợc thể hiện trong phổ hấp thụ hình 3.1. Từ phổ hấp thụ ta thấy có 2 đỉnh hấp thụ ở bƣớc sóng λ= 453nm và λ = 480nm.
Hình 3.1. Phổ UV- Vis của dịch chiết với dung dịch NaOH ở các nồng độ khác nhau
58
Bảng 3.4. Mật độ quang của dịch chiết ở các nồng độ dung dịch NaOH khác nhau nm CNaOH Mật độ quang (D) M1 (0,1M) M2 (0,5M) M3 (1M) M4 (1,2M) 453 2,013 2,284 2,348 2,261 480 1,161 1,832 1,913 1,722
Khi nồng độ dung môi chiết NaOH tăng thì mật độ quang tăng ở các mẫu 1, mẫu 2 và 3, ở mẫu 4 giá trị D giảm. Tuy nhiên giá trị D thay đổi không nhiều khi thay đổi nồng độ NaOH. Từ phổ hấp thụ ta thấy: Đỉnh hấp thụ ở bƣớc sóng = 453 nm là đặc trƣng của chất màu norbixin hiện rõ ràng, còn đỉnh hấp thụ ở = 480 đặc trƣng cho bixin hiện không rõ. Điều này chứng tỏ phẩm màu annatto chiết từ hạt điều nhuộm có thành phần màu chủ yếu là norbixin, bixin đã bị kiềm hóa chuyển thành dạng muối của norbixin.
Khi tăng nồng độ dung môi, ở mẫu 4 mật độ quang giảm, có thể do quá trình chuyển hóa bixin, norbixin (thành phần chính của màu điều nhuộm) về muối natri của norbixin đã triệt để, do đó hàm lƣợng NaOH còn dƣ tan trong dung môi.
Vậy nồng độ dung môi NaOH chiết tối ƣu nhất là 1M.
3.2.1.2. Kết quả khảo sát theo phương pháp trọng lượng
Tiến hành chƣng ninh 4 mẫu nhƣ mục 3.2.1.1, lọc nóng thu đƣợc dịch chiết. Trung hòa bằng axit HCl đặc sao cho đạt giá trị pH = 5 6. Làm sạch dịch chiết bằng cách chiết với dung môi n-hexan trong phễu chiết. Chiết cho tới khi n-hexan không bị đổi màu. Đuổi dung môi dịch chiết trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 600C, thu đƣợc cao mềm annatto, sấy nhiều giờ trong tủ sấy ở nhiệt độ 550
C cho tới khô. Cân khối lƣợng cao màu thu đƣợc và tính phần trăm khối lƣợng phẩm màu.
Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.5. Trong đó: m0 : khối lƣợng hạt điều
m1 : khối lƣợng cốc ban đầu
m2 : khối lƣợng cốc + chất màu sau khi chiết m : khối lƣợng chất màu chiết đƣợc
59
Bảng 3.5. Ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaOH đến hàm lượng phẩm màu
STT Nồng độ NaOH m0 (gam) m1 (gam) m2 (gam) m (gam) % Chất màu 1 0,1M 10,008 61,062 61,746 0,684 6,835 2 0,5M 10,013 62,003 62,939 0,936 9,355 3 1M 10,012 60,910 62,139 1,229 12,285 4 1,2M 10,019 61,677 62,955 1,278 12,76
Từ kết quả thực nghiệm trên bảng 3.5 ta thấy ở nồng độ dung môi NaOH 1M cho hàm lƣợng phẩm màu cao hơn nhiều so với NaOH 0,1M và NaOH 0,5M. Với dung môi NaOH 1,2M khối lƣợng cao hơn dung môi NaOH 1M rất ít. Điều này cho thấy ở nồng độ NaOH 1M phản ứng chuyển hóa chất màu đã xảy ra hoàn toàn, ở nồng độ NaOH 1,2M khối lƣợng cao hơn có thể do NaOH còn dƣ tạo muối trong cao màu chiết đƣợc.
Vậy nồng độ chiết tối ƣu nhất là NaOH 1M.
3.2.2. Khảo sát tỷ lệ rắn – lỏng tối ưu.
3.2.2.1. Kết qu kh o sát theo mật độ quang
Chuẩn bị 5 mẫu, cho vào bình cầu cùng một lƣợng hạt điều, thay đổi thể tích dung môi và tiến hành chƣng ninh trong dung dịch NaOH tối ƣu là 1M ở thời gian 6 giờ. Khối lƣợng hạt điều/thể tích dung dịch NaOH trong mỗi mẫu nhƣ sau:
Mẫu 1: 10,003g/150ml (tỷ lệ 1/15), mẫu 2: 10,006g/200ml (tỷ lệ 1/20), mẫu 3: 10,012g/250ml (tỷ lệ 1/25), mẫu 4: 10,005g/280ml (tỷ lệ 1/28), mẫu 5: 10,008g/300ml (tỷ lệ 1/30).
Lọc nóng dịch chiết, pha loãng 100 lần: hút 1ml dịch chiết, cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng nƣớc cất. Đo UV – Vis với mẫu trống là dung dịch NaOH 1M. Kết quả thể hiện trên phổ hấp thụ hình 3.2, bảng giá trị mật độ quang 3.6.
60
Hình 3.2. Phổ UV - Vis của dịch chiết trong NaOH với tỷ lệ R/L thay đổi Bảng 3.6. Mật độ quang của dịch chiết trong dung dịch NaOH ở các tỷ lệ R/L
khác nhau
Từ phổ hấp thụ UV – Vis cho thấy mẫu 4 đạt giá trị hấp thụ quang D cao nhất, mẫu 5 giá trị D giảm. Điều này cho thấy ở tỷ lệ R/L là 1/28 thì phản ứng chuyển hóa cả hai hợp chất norbixin và bixin của hạt điều nhuộm thành muối kiềm tan trong nƣớc là tốt nhất, nên hàm lƣợng chất màu trong mẫu 4 là cao nhất.
3.2.2.2. Kết quả khảo sát theo phương pháp trọng lượng
Tiến hành đuổi dung môi, làm khô cao màu annatto tƣơng tự nhƣ mô tả trong phần khảo sát nồng độ NaOH ta thu đƣợc kết quả hàm lƣợng phẩm màu của mỗi quá trình chiết trong bảng 3.7.
nm Mẫu Mật độ quang (D) M1 M2 M3 M4 M5 452 0,385 0,448 0,567 1,087 0,698 481 0,278 0,304 0,396 0,791 0,504
61
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ R/L đến hàm lượng phẩm màu trong dung dịch NaOH
STT Thể tích NaOH (ml) m0 (gam) m1 (gam) m2 (gam) m (gam) % Chất màu 1 150 10,003 61,065 62,891 0,913 9,125 2 200 10,006 62,030 64,606 1,288 12,87 3 250 10,012 60,910 63,863 1,476 14,745 4 280 10,005 61,062 64,074 1,551 15,51 5 300 10,008 62,001 65,252 1,625 15,47
Kết quả thực nghiệm trên bảng 3.9 cho thấy với tỷ lệ khối lƣợng hạt điều nhuộm (10,005g)/thể tích dung dịch NaOH (280ml), tức là tỷ lệ R/L khoảng 1/28 sẽ cho hàm lƣợng phẩm màu hạt điều nhuộm tốt nhất là 15,51%.
3.2.3. Khảo sát thời gian chiết tối ưu.
3.2.3.1. Kết quả khảo sát theo mật độ quang
- Lấy 4 mẫu với 10g hạt điều/ 280ml dung môi NaOH 1M, đánh số thứ tự các mẫu, chƣng ninh trong các khoảng thời gian: Mẫu 1: 4h; Mẫu 2: 6h; Mẫu 3: 8h; Mẫu 4: 10h
- Lắp dụng cụ chƣng ninh, một nhánh của bình cầu có nút gắn với nhiệt kế. Tiến hành chƣng ninh trên bếp đun bình cầu ở 900C trong các thời gian là 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ.
- Lọc nóng dịch chiết, hút 1ml dịch chiết cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng nƣớc cất. Đo UV – Vis trong vùng từ 400 nm ÷ 600nm, dung dịch mẫu trống là dung dịch NaOH
Kết quả đo UV – Vis đƣợc thể hiện trong phổ hấp thụ hình 3.3, giá trị mật độ quang D của các mẫu thể hiện trên bảng 3.8.
62
Bảng 3.8. Mật độ quang của dịch chiết trong dung dịch NaOH ở các thời gian chiết khác nhau nm Mẫu Mật độ quang (D) M1 (4h) M2 (6h) M3 (8h) M4 (10h) 452 0,487 0,887 1,395 0,586 481 0,306 0,687 0,983 0,392
Hình 3.3. Phổ UV-Vis của dịch chiết trong dung dịch NaOH với thời gian chiết thay đổi
- Từ phổ hấp thụ phân tử của các mẫu dịch chiết trong các thời gian chiết tăng dần ta thấy độ hấp thụ quang tăng dần ở các mẫu 1, mẫu 2 và 3, mẫu 4 giảm xuống.
- Mẫu 3 đạt giá trị cực đại hấp thụ
- Tăng thời gian chiết ta thấy mật độ quang giảm ở mẫu 4 là do thời gian gia nhiệt quá lâu các hợp chất màu có thể bị biến đổi cấu trúc. Các hợp chất mang màu trong hạt điều nhuộm có hệ thống nối đôi liên hợp nên khi gia nhiệt thời gian dài có thể dẫn đến phá hủy hệ thống nối đôi cách này, làm phá vỡ cấu trúc các hợp chất có màu.
63
3.2.3.2. Kết quả khảo sát theo phương pháp trọng lượng
Tiến hành đuổi dung môi, làm khô cao màu annatto tƣơng tự nhƣ mô tả trong phần khảo sát nồng độ NaOH ta thu đƣợc kết quả thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng phẩm màu trong dung dịch NaOH STT Thời gian (giờ) m0 (gam) m1 (gam) m2 (gam) m (gam) % Chất màu 1 4 10,003 62,003 64,228 1,112 11,12 2 6 10,026 61,173 64,188 1,357 13.54 3 8 10,005 61,175 64,429 1,627 16,26 4 10 10,030 60,908 63,815 1,453 14,49 Sự kéo dài thêm thời gian không làm tăng hàm lƣợng màu. Quá trình chiết tốt nhất khi chƣng ninh 10g hạt điều trong 280ml dung dịch NaOH 1M với thời gian 8 giờ đạt 16,26%.
Quá trình khảo sát các điều kiện tối ƣu đã xây dựng đƣợc quy trình chiết tối ƣu bằng phƣơng pháp kiềm hóa. Nghiên cứu khả năng chiết phẩm màu của hạt điều nhuộm bằng dung dịch NaOH với nồng độ dung dịch chiết NaOH 1M, tỷ lệ rắn/lỏng là 10(g)/280(ml) trong thời gian 8 giờ ở nhiệt độ chiết là 90oC sẽ thu đƣợc phần trăm hàm lƣợng phẩm màu từ hạt điều nhuộm là 16,26%.
3.3. Xây dựng quy trình chiết annatto từ hạt điều nhuộm trong dung môi nước
3.3.1. Khảo sát thời gian chiết tối ưu
3.3.1.1. Kết qu kh o sát theo mật độ quang
Điều kiện tiến hành: Chuẩn bị các bình cầu 500ml sạch, cho vào đó 300 ml dung môi nƣớc, sau đó cho vào các bình cầu 30g hạt điều rồi tiến hành chƣng ninh ở 1000
C trong thời gian khác nhau. Lọc nóng thu đƣợc dịch chiết. Chuyển toàn bộ màu trong dịch chiết vào dung môi etyl axetat bằng cách chiết nhiều lần với 100ml etyl axetat trong phễu chiết. Pha loãng 25 lần: hút 1ml dịch chiết cho vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch bằng etyl axetat. Đo UV - Vis với mẫu trống là dung môi etyl axetat.
64
Kết quả thể hiện trong phổ hấp thụ hình 3.4, bảng 3.10
Bảng 3.10. Mật độ quang của dịch chiết trong dung môi nước ở các thời gian chiết khác nhau nm Thời gian Mật độ quang (D) M1 16h M2 20h M3 24h M4 28h 456 1,758 2,195 2,091 1,813 487 1,515 1,952 1,821 1,535
Hình 3.4. Phổ UV- Vis của dịch chiết trong dung môi nước với thời gian thay đổi
Từ kết quả thực nghiệm ta thấy, ở thời gian chiết 20h thì khả năng hấp thụ màu của dịch chiết là tốt nhất, tức hàm lƣợng màu trong dịch chiết là cao nhất. Kéo dài thời gian chiết không làm tăng hiệu quả quá trình chiết mà có thể làm phân hủy các phần tử mang màu.
Trong phổ hấp thụ có hai đỉnh pic rất rõ ở bƣớc sóng = 456nm và = 487 nm, điều này chứng tỏ có cả hai thành phần màu bixin và norbixin trong dịch chiết, khác với trong dung dịch kiềm chất màu bixin không cho đỉnh hấp thụ rõ ràng.
65
Tiến hành chƣng ninh 4 mẫu nhƣ mục 3.3.1.1, lọc nóng thu đƣợc dịch chiết, tiếp tục lọc bằng giấy lọc thu đƣợc dịch chiết sạch. Đuổi dung môi dịch chiết trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 600C, thu đƣợc cao mềm annatto, sấy nhiều giờ trong tủ sấy ở nhiệt độ 550C cho tới khô. Cân khối lƣợng cao màu thu đƣợc và tính phần trăm khối lƣợng phẩm màu.
Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng phẩm màu trong dung môi nước
STT Thời gian (giờ) m0 (gam) m1 (gam) m2 (gam) m (gam) % Chất màu 1 16 30,006 62,003 62,324 0,321 1,07 2 20 30,011 61,173 61,710 0,537 1,79 3 24 30,015 61,062 61,464 0,402 1,34 4 28 30,001 60,908 61,166 0,258 0,86
Sự kéo dài thời gian chƣng ninh chỉ làm phân hủy các phần tử mang màu. Quá trình chiết tốt nhất khi chƣng ninh 30g hạt điều trong 300ml dung môi nƣớc với thời gian 20 giờ cho hàm lƣợng phẩm màu đạt 1,79%.
3.3.2. Khảo sát tỷ lệ rắn – lỏng
3.3.2.2. Kết qu kh o sát theo mật độ quang
Tiến hành tƣơng tự quy trình khảo sát theo thời gian, thay đổi thể tích dung môi nƣớc, giữ nguyên khối lƣợng hạt điều. Các mẫu đem chƣng ninh có khối lƣợng hạt điều/ thể tích dung môi tƣơng ứng nhƣ sau:
Mẫu 1: 10,021g/300ml (tỷ lệ 1/30), Mẫu 2: 12,013g/300ml (1/25), Mẫu 3: 15,009g/300ml (tỷ lệ 1/20), Mẫu 4: 20,015g/300ml (tỷ lệ 1/15).
Chƣng ninh trong khoảng thời gian tối ƣu vừa khảo sát là 20 giờ. Lọc nóng thu đƣợc dịch chiết. Chuyển toàn bộ màu trong dịch chiết vào dung môi etyl axetat bằng cách chiết nhiều lần với 100ml etyl axetat trong phễu chiết. Pha loãng 25 lần: hút 1ml dịch chiết cho vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch bằng etyl axetat.
66
Đo UV - Vis với mẫu trống là dung môi etyl axetat. Kết quả thể hiện trong phổ hấp thụ hình 3.5, bảng 3.12.
Bảng 3.12. Mật độ quang của dịch chiết trong dung môi nước ở các tỷ lệ R/L khác nhau nm Mẫu Mật độ quang (D) M1 M2 M3 M4 456 1,504 2,256 2,540 1,739 487 1,292 2,195 2,447 1,533
Hình 3.5. Phổ UV- Vis của dịch chiết trong dung môi nước với tỷ lệ R/L thay đổi
Dựa vào phổ, ta thấy mật độ quang D tăng ở mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3 và giảm ở mẫu 4, tức là mẫu có tỉ lệ R/L là 15,009g/300ml (tỷ lệ 1/20) tối ƣu. Điều đó chứng tỏ với tỉ lệ R/L là 1/20 thì quá trình tách chiết norbixin trong nƣớc đƣợc hiệu quả nhất nên mật độ quang D ở mẫu 3 cao nhất.
3.3.2.2. Kết qu kh o sát theo phương pháp trọng lượng
Tiến hành đuổi dung môi, làm khô cao màu annatto tƣơng tự nhƣ mô tả trong phần khảo sát thời gian trên ta thu đƣợc kết quả hàm lƣợng phẩm màu của mỗi quá trình chiết trong bảng 3.13.
M1 M3 M2
67
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tỉ lệ R/L đến hàm lượng phẩm màu trong dung môi nước
STT m0 (gam) m1 (gam) m2 (gam) m (gam) % Chất màu 1 10,021 61,065 61,413 0,078 0,78 2 12,013 62,030 62,202 0,172 1,43 3 15,009 60,910 61,288 0,378 2,52 4 20,015 61,175 61,677 0,502 2,51
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy với tỷ lệ khối lƣợng hạt điều nhuộm (15,015g)/thể tích dung môi nƣớc (300ml), tức là tỷ lệ R/L khoảng 1/20 thì giá trị mật độ quang D là lớn nhất, tức hàm lƣợng màu trong dịch chiết mẫu 3 là lớn nhất.
Quá trình khảo sát các điều kiện tối ƣu đã xây dựng đƣợc quy trình chiết annatto tối ƣu bằng dung môi nƣớc. Nghiên cứu khả năng chiết phẩm màu của hạt điều nhuộm bằng dung môi nƣớc tỷ lệ rắn/lỏng là 15,009g/300ml (tỷ lệ 1/20) trong thời gian 20 giờ ở nhiệt độ chiết là 100oC sẽ thu đƣợc phần trăm hàm lƣợng phẩm màu từ hạt điều nhuộm là 2,52%.
3.4. Điều kiện tối ưu về phương pháp
Sau khi thực hiện 2 quy trình chiết annatto trong 2 dung môi khác nhau thu đƣợc kết quả thể hiện trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả phầm trăm hàm lượng phẩm màu của 2 quy trình
Dung môi m1 (g) V (ml) m2 (g) Thời gian chiết
% Chất màu NaOH 1M 10,005 280 1,627 8h 16,26
Nƣớc 15,009 300 0,378 20h 2,52 Trong đó m1: khối lƣợng hạt điều đem đi chiết
V: thể tích dung môi chiết
m2: khối lƣợng phẩm màu thu đƣợc
68
nghiệm B4 – Đại học Sƣ phạm – Đà Nẵng. Từ kết quả trên ta thấy, hàm lƣợng phần trăm của quy trình chiết tách phẩm màu annatto trong dung môi kiềm NaOH là cao hơn. Sản phẩm cao màu annatto thu đƣợc bảo quản dễ dàng, thành phần chủ yếu của nó là norbixin (đã trung hòa) nên dễ tan trong nƣớc. Dung môi kiềm phản ứng lấy đƣợc cả hai thành phần chính trong phẩm màu annatto là bixin và norbixin nên hiệu suất thu đƣợc là cao nhất.
Sản phẩm cao màu chiết trong dung môi nƣớc khó bảo quản, dễ bị mốc do có nhiều thành phần hữu cơ khác của thực vật nhƣ: protein, xenlulo,… Hàm lƣợng