Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis ·································

Không phụ thuộc vào vùng phổ, các máy đo độ truyền quang và độ hấp thụ (mật độ quang) của dung dịch bao gồm năm bộ phận cơ bản sau:

- Nguồn bức xạ có năng lƣợng ổn định.

- Một bộ lọc sóng cho phép tạo ra bức xạ đơn sắc có bƣớc sóng thích hợp với chất nghiên cứu.

- Ngăn đựng mẫu gồm các cuvet chứa dung dịch đo.

- Đetector là loại thiết bị có khả năng thu những thông tin: cơ, điện, quang thành những tín hiệu, thƣờng là tín hiệu điện.

45 - Bộ phận chỉ thị của kết quả đo.

Tùy theo cấu tạo của các loại thiết bị mà ngƣời ta chia ra làm hai loại máy đo quang là máy một chùm tia và máy hai chùm tia.

Sơ đồ của máy phổ trắc quang đƣợc biểu diễn trên hình 1.14. 

Hình 1.14. Sơ đồ máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis

Trong đó: (1) – Nguồn phát bức xạ (4) – Dung dịch chất nghiên cứu (2) – Bộ tạo tia đơn sắc (5) – Dung môi

(3) – Bộ chia chùm sáng (6) – Detector (7) – Bộ tự ghi

Các thế hệ máy phổ hiện nay thƣờng đƣợc nối với máy vi tính, do đó việc ghi phổ hết sức thuận lợi nhờ có những chƣơng trình đo tự động theo các chế độ khác nhau. Ngoài ra, còn có thể lƣu giữ phổ đối chiếu và so sánh khi cần thiết.

Để phát bức xạ tử ngoại ta dùng đèn đơteri (D2) còn để phát bức xạ khả kiến ngƣời ta dùng đèn W/I2. Bộ tạo đơn sắc (thƣờng dùng lăng kính thạch anh hoặc cách tử) có nhiệm vụ tách riêng từng dải sóng hẹp (đơn sắc). Bộ phận chia chùm sáng sẽ hƣớng chùm tia đơn sắc luân phiên đi tới cuvet đựng dung dịch mẫu và cuvet đựng dung môi. Bộ phận phân tích (detector) sẽ so sánh cƣờng độ chùm sáng đi qua dung dịch (I) và đi qua dung môi (Io). Tín hiệu quang đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Sau khi đƣợc phóng đại, tín hiệu sẽ đƣợc chuyển sang bộ phận tự ghi để vẽ đƣờng cong sự phụ thuộc của lgIo/I vào bƣớc sóng.

Dung môi dùng để đo UV-Vis không đƣợc hấp thụ ở vùng phổ cần đo. Ngƣời ta thƣờng dùng các loại dung môi nhƣ: metanol, etanol, nƣớc…Ngoài ra ngƣời ta còn sử dụng các loại dung môi không màu nhƣ clorofom, dioxan, benzen…Trong khi đo UV-Vis thì dung môi đóng vai trò quan trọng nên dung môi phải đƣợc tinh

(1) (2) (7) quy trìn h đã chọ n (5) (3) (4) (6)

46

chế một cách cẩn thận. Nếu dung môi có lẫn tạp chất chỉ một lƣợng nhỏ thì cũng làm sai lệch kết quả đo.

Để đo đƣợc chính xác trong một số trƣờng hợp ta phải chạy Baseline lại nhƣ: - Đo các mẫu với các dung môi khác nhau. Ví dụ nhƣ mẫu tan trong dung môi là metanol nhƣng mẫu khác lại dùng dung môi là etanol.

- Để một thời gian lâu ta không sử dụng thì ta phải chạy Baseline lại. Khi ta tiến hành đo UV-Vis thì ta sẽ thu đƣợc độ hấp thụ mol và cƣờng độ hấp thụ của chất.

Chỉ có các máy phổ đặc biệt mới đo đƣợc ở vùng tử ngoại xa (λ < 200nm). Các máy phổ UV-Vis thông thƣờng đều ghi phổ trong vùng tử ngoại gần và vùng khả kiến (λ từ 200 đến 800nm), một số máy có thể đo ở vùng hồng ngoại gần (λ = 1000nm).

47

CHƯ NG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯ NG PH P NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất

2.1.1. Thu gom nguyên liệu

Nguyên liệu đƣợc thu mua ngẫu nhiên tại chợ Hòa Khánh, Thành phố Đà Nẵng, có nguồn gốc chủ yếu ở Quảng Nam, thƣờng đƣợc gọi là hạt cari.

Hạt điều nhuộm thu mua thƣờng là loại hạt già, khô, có màu đỏ sẫm, (xem hình 2.1).

Hình 2.1. Hạt điều nhuộm khô 2.1.2. Xử lí nguyên liệu

Nguyên liệu đƣợc thu mua ngẫu nhiên cần loại bỏ các hạt lép, rác sau đó rửa sạch, sấy khô 400C. Bảo quản hạt điều sạch trong lọ kín.

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.1.3.1.Thiết bị - dụng cụ

Bộ dụng cụ chƣng ninh, máy đo quang UV-Vis, máy đo pH (phòng thí nghiệm khoa Hoá, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng), máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS100 Perkin Elmer (Trung tâm kỹ thuật đo lƣờng chất lƣợng II, số 2, Ngô Quyền, Đà Nẵng).

Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thuỷ tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp đun bình cầu, bếp cách thuỷ, cốc sứ, các loại pipet, bình định mức, bình hút ẩm, giấy lọc, …

2.1.3.2. Hóa chất:

48 KOH, n-hexan, etanol, etyl axetat, nƣớc cất.

2.2. Sơ đồ quy trình nghiên cứu

S ĐỒ NGHIÊN CỨU

Cao Màu 1 Cao màu 2

Định tính Cảm quan, hàm lƣợng Định lƣợng các kim loại nặng Đánh giá chất lƣợng phẩm màu CAO MÀU 1 Chiết bằng kiềm

loãng Chiết bằng dung môi nƣớc

Hạt Điều Nhuộm

Khảo sát các quy trình chiết tách phẩm màu annatto

Xử lý nguyên liệu * Làm sạch * Sấy khô Kiểm tra một số chỉ tiêu của nguyên liệu: độ ẩm, thành phần hữu cơ, vô cơ…

Thời gian đun Nồng độ tối ƣu

49

2.3. Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí [3], [10]

2.3.1. Xác định độ ẩm

Để xác định độ ẩm tiến hành sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ trong khoảng 950-1100C. Tiến hành thí nghiệm với 5 mẫu hạt điều và lấy kết quả trung bình.

- Chuẩn bị các chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ đƣợc rửa sạch và đƣợc sấy khô trong tủ sấy, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đem cân lại đến khối lƣợng không đổi m1.

- Mẫu hạt điều để xác định độ ẩm là các mẫu thu mua tại chợ Cồn – Đà Nẵng, lấy ngẫu nhiên. Cân lấy lƣợng hạt chính xác m2 trên cân phân tích, cho vào các chén sứ đã đƣợc chuẩn bị sẵn và sấy ở nhiệt độ trên. Cứ sau 5h lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân, đến khi khối lƣợng mẫu và cốc không đổi m3.

- Khối lƣợng ẩm của mỗi mẫu là hiệu số giữa khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy m = (m1 + m2) – m3. Độ ẩm trung bình của các mẫu tính ra % theo khối lƣợng hạt ban đầu.

Công thức:

* Độ ẩm của mỗi mẫu

W(%) = ( ) 100% 2 3 2 1   m m m m ( 2.1) * Độ ẩm trung bình WTB(%) = 5 (%) W 5 1  (2.2) Trong đó:

m1: Khối lƣợng chén sứ (g); m2: Khối lƣợng hạt điều nhuộm (g) m3: Khối lƣợng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g)

W (%): Độ ẩm của mỗi mẫu; Wtb (%): Độ ẩm trung bình

2.3.2. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu

Để xác định hàm lƣợng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động vật, thực vật ngƣời ta dùng các phƣơng pháp tro hóa mẫu.

50

Các mẫu hạt điều nhuộm (khối lƣợng m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục đƣợc sử dụng để tro hóa. Các mẫu đƣợc đốt trên bếp điện, than hóa sơ bộ, sau đó cho vào lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở nhiệt độ 500-5500C trong thời gian từ 4 - 6 tiếng, cho đến khi thu đƣợc tro trắng.

Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lƣợng không đổi, có khối lƣợng m4. Khối lƣợng tro chính là phần chất còn lại sau khi nung.

Công thức tính: % tro = ( ) 100% 2 4 2 1   m m m m ( 2.3) % tro trung bình = 5 5 1  ( 2.4) Trong đó: m1: Khối lƣợng chén sứ (g)

m2: Khối lƣợng hạt điều nhuộm ban đầu (g)

m4: Khối lƣợng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)

2.3.3. Xác định hàm lượng một số kim loại trong hạt điều nhuộm, trong cao annatto bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

Tro thu đƣợc sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định mức bằng nƣớc cất và xác định hàm lƣợng kim loại bằng phƣơng pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử. Mẫu đƣợc gửi đến Trung tâm kỹ thuật đo lƣờng chất lƣợng II – số 2 Ngô Quyền – TP. Đà Nẵng để xác định hàm lƣợng một số kim loại: Zn, Cu, Pb.

Sau khi lựa chọn quy trình chiết tách phẩm màu annatto hiệu quả, thực hiện lại quy trình đã chọn, phẩm màu thu đƣợc đem gửi Trung tâm kỹ thuật đo lƣờng chất lƣợng II – số 2 Ngô Quyền – TP. Đà Nẵng để xác định hàm lƣợng một số kim loại nặng: As, Hg, Pb.

Thiết bị đo quang phổ hấp thụ nguyên tử là máy AAnalyst100 của hãng Perkin Elmer, Mỹ.

51

2.4. Phương pháp chiết và khảo sát các điều kiện chiết annatto từ hạt điều nhuộm

Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nƣớc, chúng tôi lựa chọn hai dung môi NaOH (là dung môi chiết tách đƣợc bixin hiệu quả nhất) và H2O (là dung môi chiết tách norbixin hiệu quả nhất). Chúng tôi dùng phƣơng pháp chiết là phƣơng pháp chƣng ninh cho cả hai loại dung môi trên.

2.4.1. Phương pháp chưng ninh

Cân chính xác lƣợng mẫu cần chƣng ninh, cho vào bình cầu đã chứa thể tích dung môi xác định. Lắp hệ thống sinh hàn - bình cầu cố định vào giá đỡ. Đun nóng mẫu với dung môi trong bình cầu có sinh hàn hồi lƣu ở nhiệt độ bay hơi của dung môi, lọc nóng. Dịch chiết thu đƣợc bảo quản trong bình tam giác có nút nhám, để trong bóng tối (xem hình 2.2).

Hình 2.2. Bộ dụng cụ chưng ninh 2.4.2. Khảo sát điều kiện chưng ninh

Trong điều kiện các dụng cụ đƣợc trang bị tại phòng thí nghiệm, bình cầu dùng để chiết có thể tích tối đa 1000ml. Quá trình chƣng ninh đều tiến hành ở nhiệt độ bay hơi của dung môi, do đó khảo sát điều kiện chiết ta tiến hành khảo sát 3 yếu tố:

52 - Nồng độ dung môi chiết (đối với NaOH) - Thời gian chiết

- Tỷ lệ R/L (khối lƣợng hạt điều/ thể tích dung môi chiết)

Hầu hết các hợp chất chính trong dịch chiết từ hạt điều nhuộm là các hợp chất có hệ thống nối đôi liên hợp, có khả năng hấp thụ ánh sáng và một số hợp chất còn có màu. Nên hiệu quả của quá trình chiết đƣợc thể hiện ở độ hấp thụ quang D. Độ hấp thụ quang càng lớn thì lƣợng chất đƣợc chiết ra càng nhiều. Vì vậy sử dụng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) để đo độ hấp thụ quang của dịch chiết. Dịch chiết các mẫu pha loãng chính xác trong bình định mức, đem đo UV – Vis trong vùng từ 400 – 600nm.

(1) (2)

Hình 2.3. Dịch chiết trong dung môi nước (1), dịch chiết trong dung dịch kiềm NaOH (2)

Kiểm tra hiệu suất chiết tách của mỗi điều kiện khảo sát bằng cách đuổi dung môi để thu đƣợc phẩm màu annatto. So sánh hàm lƣợng phẩm màu, chọn ra giá trị tối ƣu về phƣơng pháp.

2.5. Kiểm tra, đánh giá chất lượng phẩm màu annatto [1], [17]

Cao annatto thu đƣợc sau khi đuổi dung môi phải đƣợc kiểm tra theo thông tƣ của Bộ Y Tế ban hành “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm - Phẩm màu”.

53

2.5.1. Kiểm tra định tính:

Độ tan: Tan trong dung dịch kiềm, ít tan trong ethanol.

Hấp thụ UV-Vis: Dung dịch mẫu thử 0,5% trong dung dịch KOH Có cực đại hấp thụ tại khoảng 453 và 482 nm.

2.5.2. Đánh giá cảm quan và kiểm tra hàm lượng kim loại nặng của phẩm màu annatto

C m quan:Bột màu đỏ nâu sẫm đến đỏ tím.

Arsen: Không đƣợc quá 3 mg/kg.

Chì: Không đƣợc quá 2 mg/kg.

Thủy ngân: Không đƣợc quá 1 mg/kg.

2.5.3. Định lượng

Hàm lượng Tổng các chất màu: không thấp hơn 35% (tính theo norbixin).

2.6. Phương pháp định lượng tổng phẩm màu

Để xác định đƣợc hàm lƣợng tổng phẩm màu annatto trong cao màu phải tiến hành theo hƣớng dẫn trong chuyên luận định lƣợng tổng chất màu bằng phƣơng pháp quang phổ trong JECFA monograph 1-Vol. 4 - quy trình 1, với các điều kiện nhƣ sau:

Dung môi: dung dịch KOH 0,5%

Đo độ hấp thụ quang tại λmax ~ 482 nm. Độ hấp thụ riêng A1%

1cm = 2.870.

Quy trình 1:

Quy trình 1 dùng cho những hợp chất màu tan trong nƣớc.

Nguyên tắc: Mật độ quang của 1 dung dịch màu đƣợc đo tại λmax và hàm lƣợng của hợp chất đó đƣợc tính dựa vào giá trị hệ số hấp thụ của dung dịch chuẩn, giá trị này đƣợc suy ra từ phổ của dung dịch chuẩn đó.

Dụng cụ:

- Máy đo UV-Vis với độ chính xác cao (±1% ), đo mật độ quang trong vùng 350-700 nm với độ rộng khe 10 nm hoặc nhỏ hơn.

54

Quy trình 1: Cân chính xác 0.25 g (±0.02 g) mẫu (W). Hòa tan bằng nƣớc cất hoặc dung môi phù hợp rồi chuyển vào bình định mức 1l, định mức đến vạch. Pha loãng dung dịch đến nồng độ mong muốn tùy vào phổ của dung dịch chuẩn. Dùng nƣớc cất hoặc dung môi làm mẫu trống, đo mật độ quang (A)

% chất màu = 100 x (A/A1%1cm) x (F/W)

Trong đó: A là mật độ quang của dung dịch mẫu phân tích, A1%1cm là mật độ quang của dung dịch chuẩn

a là hệ số hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn (g-cm) F là hệ số pha loãng (F = V dd pha loãng/ V dd đã pha chuẩn)

55

CHƯ NG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lí của hạt điều nhuộm

3.1.1. Độ ẩm

Hạt rửa sạch, để ráo, phơi khô tự nhiên và tiến hành xác định độ ẩm. Số lƣợng mẫu đƣợc lấy để xác định độ ẩm là 5 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.

Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mẫu đƣợc trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm STT m1 m2 m3 W (%) Wtb (%) 1 28,202 5,057 32,717 10,718 10,097 2 28,942 5,037 33,496 9,589 3 29,542 5,071 34,116 9,801 4 30,944 5,014 35,452 10,101 5 33,307 5,045 37,834 10,268

Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình của hạt là 10,097 %. Giá trị này có thể khác nhau khi khảo sát các mẫu hạt điều lấy vào các thời điểm khác nhau tùy vào độ tuổi, vùng miền trồng và mùa thu hái. Do nguyên liệu nghiên cứu là các mẫu hạt điều nhuộm thu mua một cách ngẫu nhiên (thƣờng là các hạt điều già) vào các thời điểm khác nhau, vì vậy độ ẩm của mẫu chỉ có tính tƣơng đối.

3.1.2. Hàm lượng tro

Lấy 5 mẫu hạt điều nhuộm đã xác định độ ẩm ở trên, nung trong lò nung ở nhiệt độ 500-5500C để xác định hàm lƣợng tro. Hàm lƣợng tro đƣợc lấy trung bình từ 5 mẫu trên. Kết quả xác định hàm lƣợng tro trung bình đƣợc trình bày ở bảng 3.2.

56

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro

Vậy hàm lƣợng tro trung bình là: 5,045%. Giá trị hàm lƣợng tro này là tƣơng đối thấp. Điều này có thể dự đoán hàm lƣợng các kim loại chứa trong hạt điều nhuộm không lớn.

3.1.3. Hàm lượng một số kim loại

Tro thu đƣợc sau khi nung các mẫu (nhƣ ở mục 3.1.2) mang hòa tan bằng dung dịch axit HNO3 loãng và định mức bằng nƣớc cất trong bình định mức 50ml, sau đó xác định hàm lƣợng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, tại trung tâm đo lƣờng chất lƣợng kỹ thuật, số 2 – Ngô Quyền. Kết quả phân tích đƣợc trình bày trên bảng 3.3.

Bảng 3.3. Bảng hàm lượng một số kim loại trong hạt điều nhuộm

Kim loại Zn2+ Cu2+ Pb2+ Hàm lƣợng (mg/kg

hạt điều nhuộm) 11,82 12,74 0,2 TCVN (mg/kg) 20,000 30,000 2,000

Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho vệ sinh thực phẩm (theo quyết định của bộ y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lƣợng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô là Pb: 2mg/kg, Zn: 20mg/kg, Cu: 30mg/kg thì hàm lƣợng kim loại nặng có trong hạt điều nhuộm thấp hơn nhiều so với hàm lƣợng tối đa cho phép. Do vậy có thể sử dụng an toàn hạt điều nhuộm trong thực phẩm. STT m1 m2 m4 % tro 1 28,202 5,057 28,463 5,161 2 28,942 5,037 29,229 5,698 3 29,542 5,071 29,788 4,851 4 30,944 5,014 31,173 4,577 5 33,307 5,045 33,556 4,936

57

Đồng thời do ảnh hƣởng của các điều kiện sinh thái và thời tiết các mùa thì hàm lƣợng kim loại trong hạt điều nhuộm ở các địa phƣơng theo từng thời gian lấy mẫu có thể khác nhau.

3.2. Xây dựng quy trình chiết tách phẩm màu annatto trong dung môi NaOH