Để xác định độ ẩm tiến hành sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ trong khoảng 950-1100C. Tiến hành thí nghiệm với 5 mẫu hạt điều và lấy kết quả trung bình.
- Chuẩn bị các chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ đƣợc rửa sạch và đƣợc sấy khô trong tủ sấy, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đem cân lại đến khối lƣợng không đổi m1.
- Mẫu hạt điều để xác định độ ẩm là các mẫu thu mua tại chợ Cồn – Đà Nẵng, lấy ngẫu nhiên. Cân lấy lƣợng hạt chính xác m2 trên cân phân tích, cho vào các chén sứ đã đƣợc chuẩn bị sẵn và sấy ở nhiệt độ trên. Cứ sau 5h lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân, đến khi khối lƣợng mẫu và cốc không đổi m3.
- Khối lƣợng ẩm của mỗi mẫu là hiệu số giữa khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy m = (m1 + m2) – m3. Độ ẩm trung bình của các mẫu tính ra % theo khối lƣợng hạt ban đầu.
Công thức:
* Độ ẩm của mỗi mẫu
W(%) = ( ) 100% 2 3 2 1 m m m m ( 2.1) * Độ ẩm trung bình WTB(%) = 5 (%) W 5 1 (2.2) Trong đó:
m1: Khối lƣợng chén sứ (g); m2: Khối lƣợng hạt điều nhuộm (g) m3: Khối lƣợng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g)
W (%): Độ ẩm của mỗi mẫu; Wtb (%): Độ ẩm trung bình
2.3.2. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu
Để xác định hàm lƣợng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động vật, thực vật ngƣời ta dùng các phƣơng pháp tro hóa mẫu.
50
Các mẫu hạt điều nhuộm (khối lƣợng m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục đƣợc sử dụng để tro hóa. Các mẫu đƣợc đốt trên bếp điện, than hóa sơ bộ, sau đó cho vào lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở nhiệt độ 500-5500C trong thời gian từ 4 - 6 tiếng, cho đến khi thu đƣợc tro trắng.
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lƣợng không đổi, có khối lƣợng m4. Khối lƣợng tro chính là phần chất còn lại sau khi nung.
Công thức tính: % tro = ( ) 100% 2 4 2 1 m m m m ( 2.3) % tro trung bình = 5 5 1 ( 2.4) Trong đó: m1: Khối lƣợng chén sứ (g)
m2: Khối lƣợng hạt điều nhuộm ban đầu (g)
m4: Khối lƣợng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)
2.3.3. Xác định hàm lượng một số kim loại trong hạt điều nhuộm, trong cao annatto bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
Tro thu đƣợc sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định mức bằng nƣớc cất và xác định hàm lƣợng kim loại bằng phƣơng pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử. Mẫu đƣợc gửi đến Trung tâm kỹ thuật đo lƣờng chất lƣợng II – số 2 Ngô Quyền – TP. Đà Nẵng để xác định hàm lƣợng một số kim loại: Zn, Cu, Pb.
Sau khi lựa chọn quy trình chiết tách phẩm màu annatto hiệu quả, thực hiện lại quy trình đã chọn, phẩm màu thu đƣợc đem gửi Trung tâm kỹ thuật đo lƣờng chất lƣợng II – số 2 Ngô Quyền – TP. Đà Nẵng để xác định hàm lƣợng một số kim loại nặng: As, Hg, Pb.
Thiết bị đo quang phổ hấp thụ nguyên tử là máy AAnalyst100 của hãng Perkin Elmer, Mỹ.
51
2.4. Phương pháp chiết và khảo sát các điều kiện chiết annatto từ hạt điều nhuộm
Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nƣớc, chúng tôi lựa chọn hai dung môi NaOH (là dung môi chiết tách đƣợc bixin hiệu quả nhất) và H2O (là dung môi chiết tách norbixin hiệu quả nhất). Chúng tôi dùng phƣơng pháp chiết là phƣơng pháp chƣng ninh cho cả hai loại dung môi trên.
2.4.1. Phương pháp chưng ninh
Cân chính xác lƣợng mẫu cần chƣng ninh, cho vào bình cầu đã chứa thể tích dung môi xác định. Lắp hệ thống sinh hàn - bình cầu cố định vào giá đỡ. Đun nóng mẫu với dung môi trong bình cầu có sinh hàn hồi lƣu ở nhiệt độ bay hơi của dung môi, lọc nóng. Dịch chiết thu đƣợc bảo quản trong bình tam giác có nút nhám, để trong bóng tối (xem hình 2.2).
Hình 2.2. Bộ dụng cụ chưng ninh 2.4.2. Khảo sát điều kiện chưng ninh
Trong điều kiện các dụng cụ đƣợc trang bị tại phòng thí nghiệm, bình cầu dùng để chiết có thể tích tối đa 1000ml. Quá trình chƣng ninh đều tiến hành ở nhiệt độ bay hơi của dung môi, do đó khảo sát điều kiện chiết ta tiến hành khảo sát 3 yếu tố:
52 - Nồng độ dung môi chiết (đối với NaOH) - Thời gian chiết
- Tỷ lệ R/L (khối lƣợng hạt điều/ thể tích dung môi chiết)
Hầu hết các hợp chất chính trong dịch chiết từ hạt điều nhuộm là các hợp chất có hệ thống nối đôi liên hợp, có khả năng hấp thụ ánh sáng và một số hợp chất còn có màu. Nên hiệu quả của quá trình chiết đƣợc thể hiện ở độ hấp thụ quang D. Độ hấp thụ quang càng lớn thì lƣợng chất đƣợc chiết ra càng nhiều. Vì vậy sử dụng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) để đo độ hấp thụ quang của dịch chiết. Dịch chiết các mẫu pha loãng chính xác trong bình định mức, đem đo UV – Vis trong vùng từ 400 – 600nm.
(1) (2)
Hình 2.3. Dịch chiết trong dung môi nước (1), dịch chiết trong dung dịch kiềm NaOH (2)
Kiểm tra hiệu suất chiết tách của mỗi điều kiện khảo sát bằng cách đuổi dung môi để thu đƣợc phẩm màu annatto. So sánh hàm lƣợng phẩm màu, chọn ra giá trị tối ƣu về phƣơng pháp.
2.5. Kiểm tra, đánh giá chất lượng phẩm màu annatto [1], [17]
Cao annatto thu đƣợc sau khi đuổi dung môi phải đƣợc kiểm tra theo thông tƣ của Bộ Y Tế ban hành “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm - Phẩm màu”.
53
2.5.1. Kiểm tra định tính:
Độ tan: Tan trong dung dịch kiềm, ít tan trong ethanol.
Hấp thụ UV-Vis: Dung dịch mẫu thử 0,5% trong dung dịch KOH Có cực đại hấp thụ tại khoảng 453 và 482 nm.
2.5.2. Đánh giá cảm quan và kiểm tra hàm lượng kim loại nặng của phẩm màu annatto
C m quan:Bột màu đỏ nâu sẫm đến đỏ tím.
Arsen: Không đƣợc quá 3 mg/kg.
Chì: Không đƣợc quá 2 mg/kg.
Thủy ngân: Không đƣợc quá 1 mg/kg.
2.5.3. Định lượng
Hàm lượng Tổng các chất màu: không thấp hơn 35% (tính theo norbixin).
2.6. Phương pháp định lượng tổng phẩm màu
Để xác định đƣợc hàm lƣợng tổng phẩm màu annatto trong cao màu phải tiến hành theo hƣớng dẫn trong chuyên luận định lƣợng tổng chất màu bằng phƣơng pháp quang phổ trong JECFA monograph 1-Vol. 4 - quy trình 1, với các điều kiện nhƣ sau:
Dung môi: dung dịch KOH 0,5%
Đo độ hấp thụ quang tại λmax ~ 482 nm. Độ hấp thụ riêng A1%
1cm = 2.870.
Quy trình 1:
Quy trình 1 dùng cho những hợp chất màu tan trong nƣớc.
Nguyên tắc: Mật độ quang của 1 dung dịch màu đƣợc đo tại λmax và hàm lƣợng của hợp chất đó đƣợc tính dựa vào giá trị hệ số hấp thụ của dung dịch chuẩn, giá trị này đƣợc suy ra từ phổ của dung dịch chuẩn đó.
Dụng cụ:
- Máy đo UV-Vis với độ chính xác cao (±1% ), đo mật độ quang trong vùng 350-700 nm với độ rộng khe 10 nm hoặc nhỏ hơn.
54
Quy trình 1: Cân chính xác 0.25 g (±0.02 g) mẫu (W). Hòa tan bằng nƣớc cất hoặc dung môi phù hợp rồi chuyển vào bình định mức 1l, định mức đến vạch. Pha loãng dung dịch đến nồng độ mong muốn tùy vào phổ của dung dịch chuẩn. Dùng nƣớc cất hoặc dung môi làm mẫu trống, đo mật độ quang (A)
% chất màu = 100 x (A/A1%1cm) x (F/W)
Trong đó: A là mật độ quang của dung dịch mẫu phân tích, A1%1cm là mật độ quang của dung dịch chuẩn
a là hệ số hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn (g-cm) F là hệ số pha loãng (F = V dd pha loãng/ V dd đã pha chuẩn)
55
CHƯ NG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lí của hạt điều nhuộm
3.1.1. Độ ẩm
Hạt rửa sạch, để ráo, phơi khô tự nhiên và tiến hành xác định độ ẩm. Số lƣợng mẫu đƣợc lấy để xác định độ ẩm là 5 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mẫu đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm STT m1 m2 m3 W (%) Wtb (%) 1 28,202 5,057 32,717 10,718 10,097 2 28,942 5,037 33,496 9,589 3 29,542 5,071 34,116 9,801 4 30,944 5,014 35,452 10,101 5 33,307 5,045 37,834 10,268
Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình của hạt là 10,097 %. Giá trị này có thể khác nhau khi khảo sát các mẫu hạt điều lấy vào các thời điểm khác nhau tùy vào độ tuổi, vùng miền trồng và mùa thu hái. Do nguyên liệu nghiên cứu là các mẫu hạt điều nhuộm thu mua một cách ngẫu nhiên (thƣờng là các hạt điều già) vào các thời điểm khác nhau, vì vậy độ ẩm của mẫu chỉ có tính tƣơng đối.
3.1.2. Hàm lượng tro
Lấy 5 mẫu hạt điều nhuộm đã xác định độ ẩm ở trên, nung trong lò nung ở nhiệt độ 500-5500C để xác định hàm lƣợng tro. Hàm lƣợng tro đƣợc lấy trung bình từ 5 mẫu trên. Kết quả xác định hàm lƣợng tro trung bình đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
56
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro
Vậy hàm lƣợng tro trung bình là: 5,045%. Giá trị hàm lƣợng tro này là tƣơng đối thấp. Điều này có thể dự đoán hàm lƣợng các kim loại chứa trong hạt điều nhuộm không lớn.
3.1.3. Hàm lượng một số kim loại
Tro thu đƣợc sau khi nung các mẫu (nhƣ ở mục 3.1.2) mang hòa tan bằng dung dịch axit HNO3 loãng và định mức bằng nƣớc cất trong bình định mức 50ml, sau đó xác định hàm lƣợng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, tại trung tâm đo lƣờng chất lƣợng kỹ thuật, số 2 – Ngô Quyền. Kết quả phân tích đƣợc trình bày trên bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bảng hàm lượng một số kim loại trong hạt điều nhuộm
Kim loại Zn2+ Cu2+ Pb2+ Hàm lƣợng (mg/kg
hạt điều nhuộm) 11,82 12,74 0,2 TCVN (mg/kg) 20,000 30,000 2,000
Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho vệ sinh thực phẩm (theo quyết định của bộ y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lƣợng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô là Pb: 2mg/kg, Zn: 20mg/kg, Cu: 30mg/kg thì hàm lƣợng kim loại nặng có trong hạt điều nhuộm thấp hơn nhiều so với hàm lƣợng tối đa cho phép. Do vậy có thể sử dụng an toàn hạt điều nhuộm trong thực phẩm. STT m1 m2 m4 % tro 1 28,202 5,057 28,463 5,161 2 28,942 5,037 29,229 5,698 3 29,542 5,071 29,788 4,851 4 30,944 5,014 31,173 4,577 5 33,307 5,045 33,556 4,936
57
Đồng thời do ảnh hƣởng của các điều kiện sinh thái và thời tiết các mùa thì hàm lƣợng kim loại trong hạt điều nhuộm ở các địa phƣơng theo từng thời gian lấy mẫu có thể khác nhau.
3.2. Xây dựng quy trình chiết tách phẩm màu annatto trong dung môi NaOH
3.2.1. Khảo sát nồng độ dung dịch NaOH chiết tối ưu
3.2.1.1. Kết quả khảo sát theo mật độ quang
Điều kiện tiến hành:
- Pha các dung dịch NaOH 0,1M; NaOH 0,5M; NaOH 1M; NaOH 1,2M. - Cho vào 4 bình cầu 2 nhánh 500ml sạch 10g hạt điều, đánh số thứ tự, tiếp tục cho lần lƣợt vào mỗi bình 200ml dung môi NaOH ở các nồng độ đã pha.
- Lắp dụng cụ chƣng ninh, một nhánh của bình cầu có nút gắn với nhiệt kế. Tiến hành chƣng ninh trên bếp đun bình cầu ở 900C [7] trong thời gian là 6 giờ.
- Lọc nóng dịch chiết, hút 1ml dịch chiết cho vào bình định mức 50ml, định mức đến vạch bằng nƣớc cất. Đo UV – Vis trong vùng từ 400 nm ÷ 600nm, dung dịch mẫu trống là dung dịch NaOH.
Kết quả đo UV – Vis đƣợc thể hiện trong phổ hấp thụ hình 3.1. Từ phổ hấp thụ ta thấy có 2 đỉnh hấp thụ ở bƣớc sóng λ= 453nm và λ = 480nm.
Hình 3.1. Phổ UV- Vis của dịch chiết với dung dịch NaOH ở các nồng độ khác nhau
58
Bảng 3.4. Mật độ quang của dịch chiết ở các nồng độ dung dịch NaOH khác nhau nm CNaOH Mật độ quang (D) M1 (0,1M) M2 (0,5M) M3 (1M) M4 (1,2M) 453 2,013 2,284 2,348 2,261 480 1,161 1,832 1,913 1,722
Khi nồng độ dung môi chiết NaOH tăng thì mật độ quang tăng ở các mẫu 1, mẫu 2 và 3, ở mẫu 4 giá trị D giảm. Tuy nhiên giá trị D thay đổi không nhiều khi thay đổi nồng độ NaOH. Từ phổ hấp thụ ta thấy: Đỉnh hấp thụ ở bƣớc sóng = 453 nm là đặc trƣng của chất màu norbixin hiện rõ ràng, còn đỉnh hấp thụ ở = 480 đặc trƣng cho bixin hiện không rõ. Điều này chứng tỏ phẩm màu annatto chiết từ hạt điều nhuộm có thành phần màu chủ yếu là norbixin, bixin đã bị kiềm hóa chuyển thành dạng muối của norbixin.
Khi tăng nồng độ dung môi, ở mẫu 4 mật độ quang giảm, có thể do quá trình chuyển hóa bixin, norbixin (thành phần chính của màu điều nhuộm) về muối natri của norbixin đã triệt để, do đó hàm lƣợng NaOH còn dƣ tan trong dung môi.
Vậy nồng độ dung môi NaOH chiết tối ƣu nhất là 1M.
3.2.1.2. Kết quả khảo sát theo phương pháp trọng lượng
Tiến hành chƣng ninh 4 mẫu nhƣ mục 3.2.1.1, lọc nóng thu đƣợc dịch chiết. Trung hòa bằng axit HCl đặc sao cho đạt giá trị pH = 5 6. Làm sạch dịch chiết bằng cách chiết với dung môi n-hexan trong phễu chiết. Chiết cho tới khi n-hexan không bị đổi màu. Đuổi dung môi dịch chiết trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 600C, thu đƣợc cao mềm annatto, sấy nhiều giờ trong tủ sấy ở nhiệt độ 550
C cho tới khô. Cân khối lƣợng cao màu thu đƣợc và tính phần trăm khối lƣợng phẩm màu.
Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.5. Trong đó: m0 : khối lƣợng hạt điều
m1 : khối lƣợng cốc ban đầu
m2 : khối lƣợng cốc + chất màu sau khi chiết m : khối lƣợng chất màu chiết đƣợc
59
Bảng 3.5. Ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaOH đến hàm lượng phẩm màu
STT Nồng độ NaOH m0 (gam) m1 (gam) m2 (gam) m (gam) % Chất màu 1 0,1M 10,008 61,062 61,746 0,684 6,835 2 0,5M 10,013 62,003 62,939 0,936 9,355 3 1M 10,012 60,910 62,139 1,229 12,285 4 1,2M 10,019 61,677 62,955 1,278 12,76
Từ kết quả thực nghiệm trên bảng 3.5 ta thấy ở nồng độ dung môi NaOH 1M cho hàm lƣợng phẩm màu cao hơn nhiều so với NaOH 0,1M và NaOH 0,5M. Với dung môi NaOH 1,2M khối lƣợng cao hơn dung môi NaOH 1M rất ít. Điều này cho thấy ở nồng độ NaOH 1M phản ứng chuyển hóa chất màu đã xảy ra hoàn toàn, ở nồng độ NaOH 1,2M khối lƣợng cao hơn có thể do NaOH còn dƣ tạo muối trong cao màu chiết đƣợc.
Vậy nồng độ chiết tối ƣu nhất là NaOH 1M.
3.2.2. Khảo sát tỷ lệ rắn – lỏng tối ưu.
3.2.2.1. Kết qu kh o sát theo mật độ quang
Chuẩn bị 5 mẫu, cho vào bình cầu cùng một lƣợng hạt điều, thay đổi thể tích dung môi và tiến hành chƣng ninh trong dung dịch NaOH tối ƣu là 1M ở thời gian 6 giờ. Khối lƣợng hạt điều/thể tích dung dịch NaOH trong mỗi mẫu nhƣ sau:
Mẫu 1: 10,003g/150ml (tỷ lệ 1/15), mẫu 2: 10,006g/200ml (tỷ lệ 1/20), mẫu 3: 10,012g/250ml (tỷ lệ 1/25), mẫu 4: 10,005g/280ml (tỷ lệ 1/28), mẫu 5: 10,008g/300ml (tỷ lệ 1/30).
Lọc nóng dịch chiết, pha loãng 100 lần: hút 1ml dịch chiết, cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng nƣớc cất. Đo UV – Vis với mẫu trống là dung dịch NaOH 1M. Kết quả thể hiện trên phổ hấp thụ hình 3.2, bảng giá trị mật độ quang 3.6.
60
Hình 3.2. Phổ UV - Vis của dịch chiết trong NaOH với tỷ lệ R/L thay đổi Bảng 3.6. Mật độ quang của dịch chiết trong dung dịch NaOH ở các tỷ lệ R/L
khác nhau
Từ phổ hấp thụ UV – Vis cho thấy mẫu 4 đạt giá trị hấp thụ quang D cao nhất, mẫu 5 giá trị D giảm. Điều này cho thấy ở tỷ lệ R/L là 1/28 thì phản ứng