CHƢƠNG 5 : THỰC NGHIỆM
5.2 Sắc ký cột cao Ea3
5.2.2 Xử lý phân đoạn Ea3.3
Hình 27: SKLM phân đoạn Ea3.3 Hình 28: SKC phân đoạn Ea3.3
Ea:Me 9:1
Phân đoạn 3 từ cao Ea ban đầu thu đƣợc sau khi cơ quay cĩ khối lƣợng 2,1 g. Sắc ký cột phân đoạn Ea3.3 bằng cột cĩ đƣờng kính 2,8 cm, khối lƣợng silica gel 60g và giải ly bằng dung mơi Ea:PE = 8:2, sau đĩ tăng dần độ phân cực dung mơi giải ly. Trong quá trình giải ly sắc ký cột hứng mỗi lọ cĩ thể tích 50 mL, đƣợc theo dõi bằng SKLM. Các lọ cho kết quả SKLM nhƣ nhau đƣợc gom lại cơ quay thu hồi dung mơi. Thu đƣợc 9 phân đoạn thể hiện kết quả ở bảng 3.
Bảng 3: Kết quả xử lý phân đoạn Ea3.3
Ký hiệu phân đoạn
Dung mơi giải ly cột
Khối lƣợng cao
(gam) Nhận xét trên SKLM
Ea3.3.1 Ea:PE = 8:2 0,152 Khơng cĩ vết chính
Ea3.3.2 Ea:PE = 9:1 0,215 Vết màu tím dơ đầu dơ đuơi
Ea3.3.3 Ea 0,307 Vết trịn tím dơ đuơi, kết tinh cho tinh thể trắng.
Ea3.3.4 Ea 0,133 Vết tím phân cực, cĩ lƣợng ít.
Ea3.3.5 Ea 0,226 2 vết màu tím và màu vàng bên dƣới, rất sát nhau.
Ea3.3.6 Ea:Me = 9:1 0,254 Cĩ nhiều vết sát nhau.
Ea3.3.7 Ea:Me =8:2 0,023 Khơng cĩ vết chính
Ea3.3.8 Ea:Me = 1:1 0,050 Vệt kéo dài.
Nhận thấy ở hai phân đoạn Ea3.3.2 và Ea3.3.3 đều cho một vết chính màu tím giống nhau, chúng tơi tiến hành thu gom chung cả hai phân đoạn, cơ quay đuổi dung mơi, tiếp tục xử lý qua cột sắc ký và đặt tên là cột Ea3A.
Cột Ea3A cĩ đƣờng kính 0,9 cm, silica gel sử dụng là 20 g, giải ly cột với dung mơi ban đầu là Ea:PE = 85:15 để loại dần các vết dơ kém phân cực hơn so với vết chính cần phân lập. Tăng dần độ phân cực dung mơi đến Ea thu đƣợc một vết tím đồng nhất, trịn trên SKLM và đặt tên hợp chất này là Ea8.
Tuy nhiên Ea8 sau khi kết tinh cho tinh thể màu trắng đục, khơng đồng nhất và bám trên thành lọ bi. Tiếp tục làm sạch Ea8 qua cột cĩ đƣờng kính 0,6 cm, khối lƣợng silica gel dùng là 10 g, dung mơi giải ly cột là Ea. Tiến hành SKLM và kết tinh lại chúng tơi thu đƣợc tinh thể Ea8 màu trắng và một vết tím trịn cĩ Rf = 0,48 trên SKLM với dung mơi giải ly Ea:Me = 9:1, khối lƣợng là 0,021 g.
Tiến hành gởi mẫu, xác định cấu trúc hợp chất Ea8 bằng phổ NMR.
Ea
Giải đốn phổ NMR hợp chất Ea8
Hợp chất Ea8 là tinh thể màu trắng (0,021 g), tan trong dung mơi C:Me = 1:1. Kết quả SKLM cho vết màu tím cĩ Rf = 0,5 đƣợc giải ly với hệ dung mơi Ea:Me = 9:1 và hiện hình vết bằng dung dịch H2SO4 20% về khối lƣợng trong metanol.
Phổ 13
C-NMR (CDCl3 và MeOD, 125 MHz) kết hợp với DEPT 90, DEPT 135 cho thấy hợp chất Ea8 cĩ 52 mũi tín hiệu carbon, trong đĩ cĩ 22 mũi dƣơng của 22 carbon dạng CH<, 8 mũi dƣơng của 8 carbon CH3; 16 mũi âm của 16 carbon
CH2 và 6 carbon tứ cấp.
Tại vùng từ trƣờng thấp:
Phổ 13C-NMR cho 8 tín hiệu ppm): 140,0; 139,2; 138,0; 137,8; 129,2; 129,1; 121,7; 117,0 đặc trƣng cho các carbon olefin.
Kết hợp với nghiên cứu tổng quan đã biết về sự hiện diện của các sterol trong cây Hydrocotyle bonariensisL.[7] nên chúng tơi dự đốn khung alycon của hợp chất Ea8 là stigmasterol và spinasterol.
Tinh thể và SKLM Ea8 với dung mơi Ea:Me=9:1
Rf = 0.5
SKLM Ea8 với dung mơi C:Me=85:15
Rf = 0.64 Cột Ea3A Cột Ea3A2
Thực vậy, các dữ liệu 13C-NMR xác thực sự hiện diện của hai loại sterol này: - Các tín hiệu Cppm): 139,2; 117,0 và 137,8; 129,1 đặc trƣng cho
spinasterol với các nối đơi ở vị trí C7-C8 và C22-C23.
- Các tín hiệu Cppm): 140,0; 121,5 và 138,0; 129,2 đặc trƣng cho
stigmasterol với các nối đơi ở vị trí C5-C6 và C22-C23.
Ngồi ra, dựa vào dữ liệu phổ 1H-NMR cho thấy rằng
- Tín hiệu ở δH (ppm) 5,37 (1H, t, J = 5 Hz) là proton ở vị trí C6 của stigmasterol.
- Tín hiệu ở δH (ppm) 5,06 (1H, dd, J1 = 4,5 Hz, J2 = 9,0 Hz) là proton ở vị trí C22 của stigmasterol.
- Tín hiệu ở δH (ppm) 5,20 (2H, dd, J1 = 3,0 Hz, J2 = 8,5 Hz) là hai proton ở vị
trí C23 của hai sterol: stigmasterol và spinasterol.
- Tín hiệu ở δH (ppm) 5,03 (1H, dd, J1 = 4,0 Hz, J2 = 8,5 Hz) là proton ở vị trí C22 của spinasterol.
- Tín hiệu ở δH (ppm) 5,15 (1H, dd, J1 = 4,5 Hz, J2 = 8,5 Hz) là proton ở vị trí C7 của spinasterol.
Tại vùng đƣờng:
- Phổ 13C-NMR cho tín hiệu cĩ độ dịch chuyển 100,7 ppm và 100,8 ppm là tín hiệu đặc trƣng của carbon anomer.
Đối với tín hiệu tại 61,2 ppm, trên phổ DEPT90 biến mất và phổ DEPT135 cho mũi âm, chứng tỏ carbon ấy dạng –CH2–. Và các tín hiệu khác trong vùng này trên phổ DEPT90 và DEPT135 đều cho mũi dƣơng cho thấy đây là carbon dạng –CH<, nên cĩ thể dự đốn đây là đƣờng glucose hoặc galactose.
- Phổ 1H-NMR cho 2 tín hiệu tại δ(ppm): 4,43 (1H, d, J = 6) và 4,40 (1H, d, J = 5,5) cho thấy cĩ hai proton anomer, và hai proton này đều ở vị trí trục, suy ra các phân tử đƣờng là dạng đồng phân .
Các tín hiệu proton trong vùng đƣờng giúp dự đốn rằng đƣờng là glucose
hoặc galactose gắn vào khung aglycon tại vị trí C3. Vậy Ea8 cĩ thể là hỗn hợp của sterol glycosid, phần aglycon là spinasterol, stigmasterol, phần glycon là
glucose hoặc galactose.
Khi tiến hành so sánh tài liệu phổ đã cơng bố của stigmasterol glycosid và spinasterol glycosid với phổ của hợp chất Ea8 thấy số liệu hầu nhƣ trùng khớp. Từ đĩ chúng tơi đƣa ra kết luận, Ea8 là hỗn hợp của 2 sterol glycosid đƣợc dự đốn với 4 phƣơng án sau:
Stigmasterol 3-O--glucopyranosid và Spinasterol 3-O--glucopyranosid; Stigmasterol 3-O--glucopyranosid và Spinasterol 3-O--galactopyranosid; Stigmasterol 3-O--galactopyranosid và Spinasterol 3-O--glucopyranosid; Stigmasterol 3-O--galactopyranosid và Spinasterol 3-O--galactopyranosid.
Cấu trúc hĩa học hợp chất Ea8
O HO OH OH O OH Stigmasterol 3-Oglucopyranosid
O OH OH OH O OH O HO OH OH O OH O OH OH OH O OH Stigmasterol 3-O-galactopyranosid Spinasterolglucopyranosid Spinasterol 3galactopyranosid
Bảng 4: Kết quả phổ 13C-NMR spinasterol glycosid
Vị trí C
13
C-NMR
(δ ppm) DEPT 90 DEPT 135 Kết luận
1 36,8 Biến mất Mũi âm –CH2– 2 33,9 Biến mất Mũi âm –CH2– 3 75,8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 4 38,5 Biến mất Mũi âm –CH2– 5 39,0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH<
6 28,9 Biến mất Mũi âm –CH2–
7 117,0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 8 139,2 Biến mất Biến mất =C< 9 50,0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH<
10 34,0 Biến mất Biến mất >C< 11 21,2 Biến mất Mũi âm –CH2–
12 38,9 Biến mất Mũi âm –CH2–
13 41,2 Biến mất Biến mất >C< 14 54,8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 15 22,8 Biến mất Mũi âm –CH2–
16 28,1 Biến mất Mũi âm –CH2–
17 54,8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 18 11,6 Biến mất Mũi dƣơng –CH3
19 11,8 Biến mất Mũi dƣơng –CH3 20 40,2 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 21 20,8 Biến mất Mũi dƣơng –CH3 22 137,8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 23 129,0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 24 50,0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 25 31,5 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 26 18,9 Biến mất Mũi dƣơng –CH3 27 20,8 Biến mất Mũi dƣơng –CH3
28 24,0 Biến mất Mũi âm –CH2–
29 12,8 Biến mất Mũi dƣơng –CH3 1' 100,7 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH– 2' 75,6 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 3' 78,8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 4' 69,6 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 5' 78,2 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 6' 61,2 Biến mất Mũi âm –CH2–
Bảng 5: So sánh số liệu phổ hợp chất Ea8 với phổ của spinasterol glycosid đã đƣợc cơng bố [4, 8]
Vị trí C Loại C Ea8 Spinasterol-3-O-β- glucopyranosid Spinasterol-3-O-- galactopyranosid 1 –CH2– 36,8 36,5 37,0 2 –CH2– 33,9 33,8 29,5 3 –CH< 75,8 76,2 78,5 4 –CH2– 38,5 38,7 34,1 5 >C= 39,0 39,7 40,0 6 –CH= 28,9 29,1 29,2 7 –CH2– 117,0 117,1 117,2 8 –CH< 139,2 138,9 139,4 9 –CH< 50,0 48,6 49,4 10 >C< 34,0 33,9 34,2 11 –CH2– 21,2 20,9 21,4 12 –CH2– 38,9 38,9 39,3 13 >C< 41,2 42,7 43,1 14 –CH< 54,8 54,4 54,9 15 –CH2– 22,8 22,4 22,8 16 –CH2– 28,1 28,0 28,3 17 –CH< 54,8 55,1 55,8
18 –CH3 11,6 11,7 11,9 19 –CH3 11,8 12,7 12,8 20 –CH< 40,2 40,2 40,7 21 –CH3 20,8 21,2 21,2 22 –CH= 137,8 137,8 138,0 23 –CH= 129,0 128,9 129,3 24 –CH< 50,0 50,6 51,1 25 –CH< 31,5 31,2 31,7 26 –CH3 18,9 18,7 20,9 27 –CH3 20,8 20,9 18,8 28 –CH2– 24,0 24,8 25,2 29 –CH3 12,8 12,0 12,0 1' –CH– 100,7 100,8 101,0 2' –CH< 75,6 73,4 73,4 3' –CH< 78,8 76,7 76,2 4' –CH< 69,6 70,0 69,9 5' –CH< 78,2 76,6 75,6 6' –CH2– 61,2 61,0 61,7
Bảng 6: Kết quả phổ 13C-NMR stigmasterol glycosid
Vị trí C
13
C-NMR
(δ ppm) DEPT 90 DEPT 135 Kết luận
1 37,2 Biến mất Mũi âm –CH2–
2 29,5 Biến mất Mũi âm –CH2– 3 79,0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 4 39,2 Biến mất Mũi âm –CH2– 5 140,0 Biến mất Biến mất >C= 6 121,7 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH=
7 33,8 Biến mất Mũi âm –CH2–
8 31,8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 9 51,0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 10 36,5 Biến mất Biến mất >C< 11 22,8 Biến mất Mũi âm –CH2– 12 39,2 Biến mất Mũi âm –CH2– 13 43,0 Biến mất Biến mất >C< 14 56,5 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH<
15 25,0 Biến mất Mũi âm –CH2–
16 29,0 Biến mất Mũi âm –CH2– 17 55,8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 18 12,3 Biến mất Mũi dƣơng –CH3
19 20,8 Biến mất Mũi dƣơng –CH3 20 40,5 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 21 21,0 Biến mất Mũi dƣơng –CH3 22 138,0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 23 129,1 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 24 51,0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 25 31,5 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 26 21,0 Biến mất Mũi dƣơng –CH3 27 18,9 Biến mất Mũi dƣơng –CH3
28 25,0 Biến mất Mũi âm –CH2–
29 12,8 Biến mất Mũi dƣơng –CH3 1' 100,8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH– 2' 75,6 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 3' 78,2 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 4' 73,2 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 5' 78,8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH< 6' 61,2 Biến mất Mũi âm –CH2–
Bảng 7: So sánh số liệu phổ hợp chất Ea8 với phổ của stigmasterol glycosid đã đƣợc cơng bố [9,13]
Vị trí C Loại C Ea8 Stigmasterol-3-O-β- glucopyranosid Stigmasterol-3-O- β- galactopyranosid 1 –CH2– 37,2 38,0 37,1 2 –CH2– 29,5 30,8 31,6 3 –CH< 79,0 78,6 78,9 4 –CH2– 39,2 39,8 41,5 5 >C= 140,0 141,4 140,2 6 –CH= 121,7 122,4 121,7 7 –CH2– 33,8 32,7 31,7 8 –CH< 31,8 32,5 31,8 9 –CH< 51,0 50,8 50,2 10 >C< 36,5 37,4 36,7 11 –CH2– 22,8 21,8 20,8 12 –CH2– 39,2 40,3 39,6 13 >C< 43,0 42,8 42,5 14 –CH< 56,5 57,4 56,7 15 –CH2– 25,0 25,0 24,0 16 –CH2– 29,0 29,8 28,6 17 –CH< 55,8 56,6 55,9
18 –CH3 12,3 12,7 11,0 19 –CH3 20,8 19,7 19,2 20 –CH< 40,5 41,3 40,1 21 –CH3 21,0 21,9 20,5 22 –CH= 138,0 139,3 138,0 23 –CH= 129,1 129,9 129,2 24 –CH< 51,0 51,9 51,1 25 –CH< 31,5 32,7 32,0 26 –CH3 21,0 21,8 19,0 27 –CH3 18,9 19,9 21,2 28 –CH2– 25,0 26,2 25,4 29 –CH3 12,8 13,0 12,0 1' –CH– 100,8 103,1 100,5 2' –CH< 75,6 75,8 71,9 3' –CH< 78,2 79,1 74,0 4' –CH< 73,2 72,2 69,9 5' –CH< 78,8 78,9 76,5 6' –CH2– 61,2 63,3 62,5