13
Nhiệt độ và sự truyền nhiệt 1.3.3.3
Nhiêt độ là yếu tố ảnh hƣởng quan trọng đến quá trình lên men bán rắn. Do đó, việc làm giảm nhiệt độ của cơ ch t trong quá trình lên men bán rắn ở quy mô công nghiệp là nhiệm vụ r t cần thiết. Do cơ ch t rắn có khả năng truyền nhiệt kém nên khi vi sinh vật phát triển sẽ tạo ra một gradient về nhiệt. Khi cơ ch t rắn tích tụ nhiệt sẽ làm tăng hàm lƣợng ẩm và gây khó khăn cho q trình truyền nhiệt. V n đề duy trì nhiệt và hàm lƣợng ẩm ổn định trong lên men bán rắn ở quy mô công nghiệp đang là bài toán nan giải trong kỹ thuật. Tuy nhiên, ngƣời ta cũng có thể thực hiện đƣợc với các thiết bị chuyên dùng đặc biệt [23, 24, 27]. Trong thực tế sản xu t tại công ty Nosafood, để khắc phục tình trạng nhiệt độ trong cơ ch t lên men bán rắn (lên men bán rắn đậu nành để sản xu t nƣớc tƣơng) thì giải pháp đƣợc đƣa ra là sau thời gian cho mốc phát triển trên cơ ch t đậu nành (khoảng 12h) sẽ dùng quạt công nghiệp để thổi vào phịng ni c y để tạo sự thơng thống khí bên trong phịng, giúp cho quá trình truyền nhiệt đƣợc thực hiện nhanh chóng để khơng ảnh hƣởng đến q trình phát triển của n m mốc.
Một số nghiên cứu và ứng dụng 1.4
Việc sử dụng n m mốc trong công nghiệp thực phẩm đã đƣợc ứng dụng rộng rãi và có nhiều thành tựu trên thế giới, và có nhiều nghiên cứu và ứng dụng nhƣ sau: Ở Nhật Bản, ứng dụng lên men bán rắn trong sản xu t enzyme, sản xu t nƣớc tƣơng (còn gọi là Koji). Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của n m mốc
Aspergillus oryzae sẽ sinh ra các enzyme amylase và protease, các enzyme này sẽ
thủy phân cơ ch t trong quá trình lên men bán rắn [29]. Việc sử dụng n m mốc
Aspergillus oryzae trong lên men đƣợc Tominaga và cộng sự nghiên cứu và công bố
năm 2006 [30] đã so sánh một số chủng A. oryzae với A. flavus cho th y rằng so với trình tự A. flavus, các gen A. oryzae có chứa các đoạn gen sản xu t aflatoxin đã ị
đột biến và loại bỏ, thay thế bằng các gen cơ sở. Mặc khác, n m mốc Aspergillus oryzae đã đƣợc sử dụng ở nhiều thế kỷ trong ngành công nghiệp thực phẩm và
14
thƣờng đƣợc coi là an tồn, và khơng có chủng A. oryzae nào đƣợc biết là sản xu t aflatoxin.
S. Okrathok và cộng sự (2018) đã thực hiện nghiên cứu “Tác dụng của bột sắn lên men với Aspergillus oryzae nhƣ là một thành phần thức ăn trong chế độ ăn của gà mái”. Nghiên cứu này đƣợc thực hiện để khảo sát các tác động của việc sử dụng bột sắn lên men với Aspergillus oryzae thay thế thành phần thức ăn để cải thiện giá trị dinh dƣỡng trong chế độ ăn của gà mái có thể đƣợc sử dụng trong chế độ ăn của gà mái lên đến 24% mà không cho th y tác động tiêu cực đến khả năng tiêu hóa ch t dinh dƣỡng, sản xu t trứng, ch t lƣợng trứng hoặc sinh hóa máu [31].
Kee-Jong Hong, Chan-Ho Lee và Sung Woo Kim đã thực hiện nghiên cứu “Lên men cải thiện ch t lƣợng dinh dƣỡng của đậu nành và các thực phẩm từ đậu nành bằng chủng n m mốc Aspergillus oryzae GB-107” [32]. Nghiên cứu này đã đánh
giá ảnh hƣởng của quá trình lên men đến ch t lƣợng dinh dƣỡng của đậu nành và thực phẩm từ đậu nành. Đậu nành và bột đậu nành đã đƣợc lên men bởi Aspergillus
oryzae GB-107 trong 48h. Sau khi lên men, hàm lƣợng ch t dinh dƣỡng cũng nhƣ
ch t ức chế trypsin của chúng đƣợc đo và so sánh với các loại đậu nành và bột đậu nành thô. Đậu nành lên men và bột đậu nành lên men chứa hơn 10% protein thô so với đậu nành thô và bột đậu nành. Hàm lƣợng acid amin thiết yếu là không thay đổi sau khi lên men. Lên men loại bỏ hầu hết các ch t ức chế trypsin từ cả đậu nành và bột đậu nành. Lên men làm tăng lƣợng peptide kích thƣớc nhỏ (<20kDa) so với đậu nành thô, trong khi giảm đáng kể peptide kích thƣớc lớn (>60kDa). Bột đậu nành lên men chứa nhiều peptide cỡ nhỏ (<20kDa) so với bột đậu nành. Bột đậu nành lên men khơng chứa peptide kích thƣớc lớn (>60kDa), trong khi 22,1% peptide trong bột đậu nành có kích thƣớc lớn (>60kDa). Tóm lại, q trình lên men làm tăng hàm lƣợng protein hòa tan, loại bỏ các ch t ức chế trypsin và giảm kích thƣớc peptide trong đậu nành và bột đậu nành. Những tác động của q trình lên men có thể làm cho thực phẩm từ đậu nành hữu ích hơn trong chế độ ăn uống của con ngƣời nhƣ một loại thực phẩm chức năng và mang lại lợi ích cho vật ni nhƣ một thành phần thức ăn mới.
15
Lên men bán rắn đƣợc ứng dụng trong công nghệ sinh học nhƣ sản xu t các enzyme: phytase, amylase, inulinase, cellulase, protease, alpha-galactosidase, lipase, tannase, laccase, chitinase, L-glutaminase, lipase [33-46] trong sản xu t các acid hữu cơ nhƣ là: lactic acid, citric acid.
Khảo sát tính ch t và khả năng kháng oxi hóa của ch t màu từ đậu đen dựa trên thay đổi của điều kiện chuẩn bị và tồn trữ [47]. Nghiên cứu tiến hành với vỏ đậu đen ở miền nam Việt Nam đƣợc tách ra sau khi ngâm, sau đó trích ch t màu bằng nƣớc. Ngâm đậu trong dung dịch acid citric 1% có thể bảo vệ anthocyanin và nâng cao nồng độ của chúng trong dịch chiết. Hàm lƣợng anthocyanin trong dịch chiết khi ngâm trong nƣớc và acid citric 1% lần lƣợt là 92 và 166mg/L. Hạ th p pH của dịch chiết xuống vùng acid dẫn đến sự thay đổi tông màu (từ đỏ nâu sang đỏ) và tác động nhẹ đến khả năng kháng oxi hóa. Bột màu đƣợc thu từ dịch chiết sau khi loại dung mơi có màu tím đen và hàm lƣợng anthocyanin khoảng 1,1%. Sau một tháng tồn trữ ở nhiệt độ th p và tránh sáng, tổng hàm lƣợng anthocyanin giảm và bị biến ch t. Đặt biệt, hoạt tính kháng oxi hóa của ch t màu vẫn đƣợc duy trì theo thời gian tồn trữ.
Chiết xu t từ đậu đen giàu anthocyanin: ứng dụng làm màu thực phẩm và tiềm năng chống bệnh tiểu đƣờng [48]. Chiết xu t giàu anthocyanin ở pH 2,5 và điều kiện bảo quản 4oC hoạt tính đƣợc bảo đảm trong 277 ngày; chiết xu t giàu anthocyanin đƣợc sử dụng nhƣ là một nguồn ch t màu tự nhiên và là ch t có hoạt tính sinh học trong việc điều trị bệnh tiểu đƣờng.
Chiết xu t từ vỏ hạt đậu đen giàu anthocyanin đƣợc ứng dụng trong việc tạo màu cho nƣớc uống thể thao. Vỏ hạt đậu đen Idaho và Otomi đƣợc chiết xu t trong nƣớc và acid citric 2% (1/50, v/v) khu y liên tục trong 4h ở 40oC, và lƣợng anthocyanin thu đƣợc 1,83mg và 1,02mgC3G/g, tƣơng ứng với hai loại đậu đen [4]; các chiết xu t giàu anthocyanin này có thể đƣợc ứng dụng là ch t màu tự nhiên thay thế cho màu tổng hợp và có khả năng kháng oxi hóa cao.
16
Việc nghiên cứu lên men bán rắn đậu đen ằng các chủng n m khác nhau
Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Rhizopus azygosporus và Rhizopus sp. No. 2 [49] cũng đã đƣợc tiến hành và tùy vào loài n m sử dụng trong quá trình lên men bán rắn khác nhau mà hoạt tính kháng oxi hóa khác nhau nhƣ khả năng oxi hóa gốc tự do DPPH, năng lực khử và khả năng khử Fe3+
thành Fe2+. Đậu đen đƣợc lên men sẽ có khả năng oxi hóa gốc tự do DPPH, năng lực khử và khả năng khử Fe3+ thành Fe2+ cao hơn đậu đen không lên men.
Ngoài ra, Peter R. Shewry và cộng sự (2002) nghiên cứu về protein của các loại ngũ cốc và khả năng tận dụng các nguồn ngũ cốc cho chế biến các sản phẩm thức ăn cho ngƣời và động vật [50].
Christine Murzyn, Claire Riehle và Maura Killian (2014) đã nghiên cứu và sử dụng bột đậu đen nhƣ là một ch t thay thế bột chức năng và là ch t tăng protein và xơ trong công nghệ làm bánh chocolate [51].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi kế thừa phƣơng pháp sản xu t tƣơng truyền thống với các nghiên cứu đã đƣợc công bố nhƣng phát triển theo một hƣớng đi riêng. Lần đầu tiên sử dụng đậu đen để sản xu t tƣơng thay đậu nành, làm tăng giá trị protein của thành phẩm và đặc biệt là trong sản phẩm không sử dụng phẩm màu mà tận dụng chính màu tự nhiên của nguyên liệu đậu đen – các hợp ch t anthocyanins – để tạo màu cho sản phẩm tƣơng.
17
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƢƠNG 2
Phƣơng tiện nghiên cứu 2.1
Địa điểm và thời gian 2.1.1
Luận văn đƣợc thực hiện tại:
Phòng F6.5 Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, trƣờng Đại Học Cơng NghiệpThành Phố Hồ Chí Minh – 12 Nguyễn Văn Bảo, phƣờng 4, quận Gò V p, Tp. Hồ Chí Minh.
Phịng NC&PTSP Cơng ty Cổ phần Nosafood – E4/20 Nguyễn HữuTrí, thị tr n Tân Túc, huyện Bình Chánh, Tp. Hồ Chí Minh
Thời gian thực hiện: từ tháng 02/2018 đến tháng 8/2018
Dụng cụ và thiết bị 2.1.2
Dụng cụ thủy tinh: Ống nghiệm, becher (50, 100, 250ml)
Máy quang phổ so màu.
Thiết bị đo cơ lý tại F4 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp TP. Hồ Chí Minh, model CT3 4500 của hãng BROOKFIELD, 90 – 265V ~ 50/60 Hz, Power 150VA.
Máy đo màu cầm tay Minolta Chromameter (CR-400, Minolta Camera Co., Osaka, Japan).
Cân điện tử Ohaus, độ chính xác 0,0001g và 0,01g.
Đĩa petri.
Bình định mức 100ml.
Ống đong 100, 500ml.
Một số dụng cụ và thiết bị liên quan khác.
Hóa chất 2.1.3
Các hóa ch t sử dụng xác định hàm lƣợng protein hòa tan theo phƣơng pháp Bradford:
18
Nƣớc c t.
Thuốc thử Bradford, thành phần thuốc thử trong 100ml nhƣ sau:
Coomassie Brilliant Blue: 0,0010g.
Ethanol tuyệt đối: 4,7g.
Phosphoric acid: 85%.
Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue đƣợc hòa tan trong ethanol trong chai màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nƣớc c t. Lắc đều và giữ lạnh dƣới 4oC.
Hóa ch t xác định mật độ tế bào n m mốc – môi trƣờng PGA:
Agar agar.
Khoai tây.
Glucose.
Peptone.
Yeast extract.
Nguyên liệu nghiên cứu 2.1.4
Nguyên liệu đậu đen sử dụng trong nghiên cứu từ nguồn cung c p của Công ty Xuân Hồng; n m mốc Aspergillus oryzae, muối sử dụng đƣợc cung c p bởi phịng NC&PTSP Cơng ty cổ phần Nosafood.
Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2
Chuẩn bị mẫu 2.2.1
Nguyên liệu đậu đen đƣợc chuẩn bị cho t t cả các thí nghiệm đƣợc mua với số lƣợng 20kg từ cùng lô sản xu t với ngày sản xu t và hạn sử dụng lần lƣợt là: 25/02/2018, 25/08/2018 và đƣợc bảo quản trong các bao PE 500g ở nhiệt độ phòng. Nguyên liệu đậu đen (500g/mỗi thí nghiệm) đƣợc rửa sạch và ngâm trong nƣớc 2h, sau đó sẽ cho h p ở nhiệt độ 121o
C, áp su t 1,5atm, trong thời gian 15 phút (từ khi đạt nhiệt độ 121o
C) (áp dụng theo cách chuẩn bị mẫu của công ty Nosafood đang sử dụng đối với nguyên liệu đậu nành trong sản xu t tƣơng).
19
Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 2.2.2
Phƣơng pháp phân tích các chỉ tiêu đƣợc thể hiện nhƣ ảng 2.1 Bảng 2.1 Phƣơng pháp phân tích các chỉ tiêu
Chỉ tiêu Phƣơng pháp
Carbohydrates AOAC 986.25 mod
Béo Phƣơng pháp nội bộ (EHC-TP2-050)
(Ref.FAO Food 14/7-1986)
Đạm Phƣơng pháp nội bộ (EHC-TP2-047)
(Ref.FAO Food 14/7-1986)
Độ ẩm Phƣơng pháo nội bộ (EHC-TP2-048)
(Ref.FAO Food 14/7-1986)
Tro tổng Phƣơng pháo nội bộ (EHC-TP2-049)
(Ref.FAO Food 14/7-1986)
Acid amin Phƣơng pháp nội bộ (EHC-TP1-044)
Sự thuần chủng của n m mốc
Aspergillus oryzae HD.PP.12/TT.VN
Protein hòa tan Phƣơng pháp Bradford (1976)
Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 2.2.3
Các thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp. Dùng phép kiểm định LSD từ phân tích ANOVA một yếu tố để so sánh sự khác nhau giữa các nghiệm thức, số liệu đƣợc thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel và phần mềm thống kê Statgraphics.
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành theo thí nghiệm dạng chuỗi, kết quả của thí nghiệm trƣớc đƣợc chọn làm thơng số cố định cho các thí nghiệm tiếp sau đó.
20
Phương pháp bố trí thí nghiệm nghiên cứu 2.2.4
Sơ đồ nhân giống nấm mốc Aspergillus oryzae 2.2.4.1
Theo sơ đồ nhân giống đang thực hiện tại công ty cổ phần Nosafood