Thành phần môi trƣờng nhân giống c p 1 và nhân giống c p 2: gạo t m 20% và bắp đã xay vỡ thành những mảnh nhỏ 50%. Gạo t m đƣợc n u chín, bắp mảnh đƣợc làm ẩm bằng nƣớc và trộn với cơm đã n u, sau đó đem h p tiệt trùng ở áp su t 1,5atm và trong thời gian 15’; môi trƣờng nhân giống đƣợc làm nguội và c y n m mốc từ các ống nghiệm vào.
Môi trƣờng nhân giống c p 1 (đƣợc gọi là mơi trƣờng bình tam giác) hỗn hợp mơi trƣờng sau khi phối trộn đƣợc trải vào các hộp nhựa hình hộp chữ nhật với kích thƣớc 12×16×6cm có nắp, trên nắp có đục lỗ nhỏ để thơng khí, sau đó đem h p tiệt
Nhân giống c p 1
Nhân giống c p 2
Định kỳ 2 tuần c y truyền giữ giống trên
môi trƣờng PGA Mốc giống
Aspergillus oryzae
Giống sản xu t
21 trùng môi trƣờng này ở 121o
C trong thời gian 15’ và để nguội c y giống n m mốc
Aspergillus oryzae vào, nuôi ở tủ m 32 – 350C trong thời gian 24h.
Môi trƣờng nhân giống c p 2 (đƣợc gọi là môi trƣờng trung gian) hỗn hợp môi trƣờng sau khi phối trộn đƣợc h p tiệt trùng và đƣợc để nguội; sau đó trộn với mơi trƣờng nhân giống c p 1 (đã đƣợc c y giống) và đem trải ra các khay có kích thƣớc dài 40cm, rộng 30cm với bề dày lớp môi trƣờng là từ 1 – 2cm, phía trên đƣợc phủ bởi một t m vải đƣợc làm ẩm nƣớc và đã đƣợc h p tiệt trùng, ni ở nhiệt độ phịng thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 48 – 72h là sử dụng đƣợc [52] (thu đƣợc giống sản xu t).
N m mốc Aspergillus oryzae đƣợc nhân giống và giữ giống trên môi trƣờng thạch
nghiêng potato glucose agar (PGA), môi trƣờng PGA đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: khoai tây rửa sạch loại bỏ vỏ và cắt hạt lựu; đun sôi với 1L nƣớc c t trong 30 phút. Lọc qua vải mỏng, thu nƣớc trong và phối trộn với các thành phần khác, đun sơi để hịa tan. Chiết rót vào các ống nghiệm và h p tiệt trùng ở 121oC trong thời gian 15’ [53].
Sơ đồ kiểm tra mật độ giống sản xuất (mật độ tế bào/1g giống) 2.2.4.2
Hình 2.2 Sơ đồ kiểm tra mật độ giống sản xu t Pha lỗng đến nồng độ thích hợp
Trải đĩa trên môi trƣờng PGA
Nuôi ở tủ m 32oC và đếm khuẩn lạc sau 12h
22
Cân 1g mẫu giống sản xu t định mức thành 100ml bằng nƣớc c t vô trùng, pha lỗng đến các nồng độ thích hợp và hút 0,1ml trang trên các đĩa môi trƣờng PGA đã h p tiệt trùng (mỗi nồng độ sử dụng 3 lần lặp), sau đó đem ni ở tủ m (32oC) và đếm khuẩn lạc sau 12h nuôi c y.
Mật độ tế bào (CFU/g) đƣợc xác định theo công thức: [53].
1 1 ... i i N A n Vf n Vf (2-1) Trong đó:
A: số tế ào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) (CFU/g) trong 1g mẫu. N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn.
ni: số lƣợng đĩa c y tại độ pha loãng thứ i. V: thể tích mẫu (ml) c y vào trong mỗi đĩa. fi: độ pha loãng tƣơng ứng.
N m mốc giống Aspergillus oryzae từ các ống nghiệm sau quá trình nhân giống 2 c p theo sơ đồ nhân giống hình 2.1 sẽ tạo thành giống sản xu t. Trƣớc khi tiến hành các khảo sát theo nội dung chi tiết của các thí nghiệm 1, 2 và 3 thì giống sản xu t phải đƣợc xác định mật độ tế bào (CFU/1 g giống sản xu t).
Kiểm tra mật độ tế bào giống sản xu t đƣợc thực hiện nhƣ hình 2.2.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 2.2.4.3
Nội dung thí nghiệm thực hiện bao gồm 2 nội dung chính:
− Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men bán rắn của n m mốc
Aspergillus oryzae trên cơ ch t đậu đen.
23
Hình 2.3 Nội dung thí nghiệm thực hiện
Từ nội dung thí nghiệm nhƣ trên, sơ đồ thí nghiệm tổng qt đƣợc bố trí nhƣ hình 2.4. Trong hình 2.4 các yếu tố đƣợc thể hiện nhƣ sau: a1, a2, a3 là tỷ lệ giống sử dụng (tỷ lệ giống so với nguyên liệu đậu đen; 1, b2, b3 nồng độ muối sử dụng; c1, c2, c3 là thời gian ủ; ax, bx, cx là các giá trị xác định đƣợc sau mỗi thí nghiệm dựa trên yếu tố theo dõi là hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc. Nguyên liệu đậu đen sau khi h p tiệt trùng đƣợc để nguội tự nhiên xuống 50 – 55oC, sau đó đƣợc c y giống sản xu t vào và ni ở nhiệt độ phịng trong thời gian 24h, sau đó đậu lên men đƣợc bổ sung thêm dung dịch nƣớc muối và cho vào các hủ thủy tinh để ủ ngoài nắng. Phƣơng pháp thực hiện nghiên cứu đƣợc bố trí cụ thể nhƣ các phần tiếp theo.
Đậu đen
Nội dung 1: khảo sát các yếu tố ảnh
hƣởng đến quá trình lên men đậu đen bằng n m mốc Aspergillus oryzae
Nội dung 2: Ứng dụng
dịch đậu đen lên men sản xu t tƣơng đen (Hoisine)
Thí nghiệm 1: xác định tỷ lệ giống ni c y Thí nghiệm 2: xác định nồng độ muối sử dụng Thí nghiệm 3: xác định thời gian ủ - Xác định công thức sản xu t tƣơng thành phẩm. - Xác định tính ch t hóa lý: độ màu, c u trúc gel của tƣơng phẩm. - Xác định hàm lƣợng protein và thành phần acid amin của tƣơng thành phẩm.
24
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Giống sản Giống sản xu t -Nƣớc ngập đậu -Thời gian 2h - Thời gian 1h - Nhiệt độ 121oC - Áp su t 1,5atm Khảo sát tỷ lệ giống Yếu tố cố định: b = 16% c = 15 ngày Xác định hàm lượng protein hòa tan
Đậu đen (500 g) Rửa và ngâm H p C y giống Thí nghiệm 1 a1 = 0,5% a2 = 1,0% a3 = 1,5% ax ax ax Xác định các thành phần cơ ản Khảo sát nồng độ muối sử dụng Yếu tố cố định: ax c = 15 ngày Xác định hàm lượng protein hịa tan
Thí nghiệm 2
b1 = 16% b2 = 18% b3 = 20%
bx
Khảo sát thời gian ủ Yếu tố cố định: ax, bx
Xác định hàm lượng protein hịa tan
Thí nghiệm 3
c1 = 15 ngày c2 = 30 ngày c3 = 45 ngày
25
Xác định các thành phần cơ bản trong nguyên liệu 2.2.5
Mục đích: xác định các thành cơ ản an đầu trong nguyên liệu đậu đen.
Nguyên liệu đậu đen đƣợc gửi đến Công ty TNHH Eurofins Sắc ký Hải Đăng địa chỉ Lô E2b-3, đƣờng D6, Khu cơng nghệ cao, quận 9, TP. Hồ Chí Minh (Văn phịng nhận mẫu: Lầu M, 141 Nguyễn Du, quận 1, TP. Hồ Chí Minh) để xác định các chỉ tiêu: Hàm lƣợng protein tổng. Hàm lƣợng carbohydrates tổng. Hàm lƣợng lipid tổng. Hàm lƣợng tro. Hàm lƣợng ẩm. Hàm lƣợng các acid amin.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của quá trình lên men nấm mốc đến hàm 2.2.6
lượng protein hòa tan
Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng của quá trình lên men n m mốc đến hàm lƣợng protein hịa tan bao gồm các thí nghiệm 1, 2 và 3 [54].
Khối lƣợng đậu đen sử dụng cho các thí nghiệm 1, 2 và 3 là 500g; khối lƣợng dung dịch nƣớc muối sử dụng là 600g.
Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ giống sản xuất sử dụng 2.2.6.1
Mục đích: xác định tỷ lệ giống sản xu t sử dụng.
Yếu tố khảo sát: khảo sát tỷ lệ giống sản xu t/nguyên liệu đậu đen ở các tỷ lệ: 0,5%, 1% và 1,5% so với khối lƣợng nguyên liệu đậu đen nghiên cứu (500g) tƣơng ứng với khối lƣợng giống sản xu t sử dụng là: 2,5g, 5g và 7,5g.
Yếu tố cố định:
Thời gian ủ: 15 ngày.
26
Yếu tố theo dõi: hàm lƣợng protein hịa tan thu đƣợc.
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện đồng thời, mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần, tổng cộng có 9 thí nghiệm.
Kết quả: xác định đƣợc tỷ lệ giống sản xu t sử dụng (ax) và kết quả này đƣợc sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 2: Xác định hàm lượng muối sử dụng 2.2.6.2
Mục đích: xác định nồng độ muối sử dụng trong quá trình lên men.
Yếu tố khảo sát: khảo sát nồng độ muối sử dụng trong quá trình ủ đậu đen lên men; với các nồng độ 16, 18 và 20% (khối lƣợng mỗi dung dịch muối là 600g).
Yếu tố cố định:
Thời gian ủ: 15 ngày.
Tỷ lệ giống (sử dụng kết quả của thí nghiệm 1).
Yếu tố theo dõi: hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch sản phẩm lên men đậu đen. Các thí nghiệm đƣợc thực hiện đồng thời, mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần, tổng cộng có 9 thí nghiệm.
Kết quả: xác định đƣợc nồng độ muối sử dụng (bx) và sử dụng kết quả này cho thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 3: Xác định thời gian ủ 2.2.6.3
Mục đích: xác định thời gian ủ thích hợp.
Yếu tố khảo sát: khảo sát thời gian ủ thích hợp cho đậu đen sau khi lên men án rắn bằng n m mốc; khảo sát ở các khoảng thời gian 15, 30 và 45 ngày.
Yếu tố cố định:
Tỷ lệ giống sản xu t ax (sử dụng kết quả thí nghiệm 1).
27
Cách tiến hành: sử dụng tỷ lệ giống ở thí nghiệm 1 (ax) và nồng độ muối ở thí nghiệm 2 (bx) để tiến hành lên men đậu đen.
Yếu tố theo dõi: hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch sản phẩm lên men đậu đen. Các thí nghiệm đƣợc thực hiện đồng thời, mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần, tổng cộng có 9 thí nghiệm.
Sản xuất tương đen từ dịch đậu đen lên men 2.2.7
Mục đích: ứng dụng dịch lên men đậu đen để sản xu t tƣơng đen (Hoisine sauce) giàu protein với ch t màu anthocyanin tự nhiên từ nguyên liệu.
Cách thực hiện: sử dụng kết quả của các thí nghiệm 1, 2 và 3 để tiến hành lên men đậu đen và sản xu t tƣơng đen (Hoisine) nhƣ quy trình sản xu t tƣơng đen đang đƣợc áp dụng tại Cơng ty Cổ phần Nosafood nhƣ hình 2.5.
Tƣơng đen thành phẩm đƣợc tiến hành xác định các tính ch t hóa lý (nhƣ đo độ màu và đo c u trúc gel) và giá trị dinh dƣỡng (xác định thành phần và hàm lƣợng các acid amin trong sản phẩm).
28
Hình 2.5 Quy trình sản xu t tƣơng đen Nguyên liệu Nguyên liệu Đậu đen Định lƣợng (500g) Ngâm (2h) H p chín (1,5atm, 15’, 121o C) C y giống (tỷ lệ ax) Ủ (thời gian cx) Muối (nồng độ bx) Xay mịn Phối trộn Thanh trùng Giải nhiệt Rót chai Hồn thiện Thành phẩm N m mốc Nhân giống ống nghiệm Nhân giống c p 1 Nhân giống c p 2 Mốc giống
29
Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Bradford 2.2.8
Xác định hàm lƣợng protein hịa tan trong các thí nghiệm và trong sản phẩm tƣơng đen ằng phƣơng pháp Bradford [55]:
Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi ƣớc sóng h p thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có ƣớc sóng h p thu cực đại là 465nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dƣơng và h p thu cực đại ở ƣớc sóng 595nm. Độ h p thu ở ƣớc sóng 595nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein.
Cách tiến hành:
Pha dung dịch thuốc thử 5X:
0.05g Coomasie Blue + 25ml etanol tuyệt đối.
Bổ sung thêm 50ml H3PO4.
Hỗn hợp đƣợc khu y đều 10’ trong tủ hút.
Bổ sung nƣớc c t vừa đủ 100ml bằng ình định mức 100ml.
Pha dung dịch thuốc thử 1X: từ dung dịch thuốc thử 5X pha loãng 5 lần thành dung dịch thuốc thử 1X bằng cách l y 10ml dung dịch thuốc thử 5X + 40ml nƣớc c t thu đƣợc 50ml dung dịch thuốc thử 1X.
Pha dung dịch chuẩn:
Cân 0,01g albumin + 1ml nƣớc c t dung dịch chuẩn 10mg/ml.
Pha loãng dung dịch chuẩn 100 lần để đƣợc dung dịch chuẩn 0,1mg/ml bằng cách l y 1ml dung dịch chuẩn 10mg/ml định mức thành 100ml trong ình định mức thu đƣợc dung dịch chuẩn 0,1mg/ml.
30 Xây dựng đƣờng chuẩn theo Bảng 2.2.
Bảng 2.2 Xây dựng đƣờng chuẩn Bradford
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nƣớc c t (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Al umin chuẩn (0,1mg/ml) (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Thuốc thử radford (ml) 5 5 5 5 5 5 Nồng độ al umin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 OD595nm
Đánh giá các tính chất hóa lý và giá trị dinh dưỡng của tương thành 2.2.9
phẩm
Đánh giá các tính ch t hóa lý của tƣơng thành phẩm: đo màu, tính ch t gel của tƣơng thành; tại Viện công nghệ sinh học và thực phẩm trƣờng Đại học Cơng nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
Xác định giá trị dinh dƣỡng của tƣơng thành phẩm:
Xác định hàm lƣợng protein hòa tan bằng phƣơng pháp Bradford [55]
Gửi tƣơng thành phẩm đến Công ty TNHH Eurofins Sắc ký Hải Đăng địa chỉ Lô E2b-3, đƣờng D6, Khu công nghệ cao, quận 9, TP. Hồ Chí Minh (Văn phịng nhận mẫu: Lầu M, 141 Nguyễn Du, quận 1, TP. Hồ Chí Minh) để xác định thành phần và hàm lƣợng các acid amin.
31
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN CHƢƠNG 3
Xác định thành phần cơ bản của nguyên liệu đậu đen 3.1
Bảng 3.1 Kết quả phân tích các thành phần cơ ản của nguyên liệu
STT Chỉ tiêu Đơn vị tính Kết quả
1 Carbohydrates % 58,3 2 Béo % 2,13 3 Đạm % 21,3 4 Alanin (tổng) g/100g 1,11 5 Acid aspartic (tổng) g/100g 2,73 6 Cysteine/Cysteine (tổng) g/100g KPH (LOD=0,02) 7 Acid glutamic (tổng) g/100g 3,01 8 Glycine (tổng) g/100g 0,91 9 Histidin (tổng) g/100g 0,6 10 4-Hydroxyprolin (tổng) g/100g KPH (LOD=0,02) 11 Isoleucine (tổng) g/100g 1,08 12 Leucine (tổng) g/100g 1,74 13 Lysine (tổng) g/100g 1,82 14 Methionine g/100g 0,06 15 Phenylalanine (tổng) g/100g 1,23 16 Proline (tổng) g/100g 1,19 17 Serin (tổng) g/100g 1,58 18 Threonine (tổng) g/100g 0,91 19 Tyrosine (tổng) g/100g 0,63 20 Valine (tổng) g/100g 1,27 21 Amino acid (tổng) g/100g 19,9 22 Độ ẩm % 14,4 23 Tro tổng % 3,98
32
Nguyên liệu đậu đen trong nghiên cứu đƣợc gửi đến công ty TNHH Eurofins Sắc ký Hải Đăng để xác định các thành phần cơ ản trƣớc khi tiến hành các khảo sát và kết quả xác định các thành phần cơ ản cũng nhƣ thành phần và hàm lƣợng các acid amin trong nguyên liệu đậu đen đƣợc thể hiện nhƣ Bảng 3.1 (chi tiết của bảng kết quả kiểm nghiệm xem phụ lục 7).
Từ kết quả bảng 3.1 tôi nhận th y hàm lƣợng protein tổng của nguyên liệu nghiên cứu là 21,3% không khác biệt với hàm lƣợng protein trong các nguyên liệu đậu đen khác là 23% [1, 2, 12]. Bảng 3.1 cho th y nguyên liệu đậu đen sử dụng cho nghiên cứu có hàm lƣợng protein tổng cao; hàm lƣợng các acid amin thiết yếu trong nguyên liệu cao đặc biệt là 3 acid amin gồm Leucin, Isoleucin và Valine chiếm hàm lƣợng cao lần lƣợt là 1,74%, 1,08% và 1,27%, 3 acid amin này có vai trị đặc biệt quan trọng trong nhóm 8 loại acid amin thiết yếu; các acid amin này còn đƣợc gọi là những stress amino acids, loại protein thƣờng dùng để phục hồi hoặc sửa chữa những tổn thƣơng từ những stress thể lực của những vận động viên và một số trƣờng hợp bị thƣơng nặng hay sau phẫu thuật, đặc biệt là cải thiện khả năng nhận thức ghi nhớ những tổn thƣơng ở não do bệnh tật hay do thƣơng tích [56].
Hàm lƣợng béo trong nguyên liệu đậu đen nghiên cứu ở mức 2,13% nên thích hợp cho q trình sản xu t lên men (theo Lê Thị Bích Phƣợng và cộng sự) [54].
Mật độ tế bào nấm mốc Aspergillus oryzae trên 1g giống sản xuất 3.2
Sản xuất nấm mốc Aspergillus oryzae 3.2.1
N m mốc Aspergillus oryzae do phòng nghiên cứu công ty cổ phần Nosafood cung c p ở dạng các ống nghiệm nhƣ hình 3.1. Giống từ ống thạch nghiêng sẽ đƣợc tiến hành nhân giống qua 2 c p: c p 1 và c p 2 nhƣ sơ đồ đã trình ày ở hình 2.1. Mơi trƣờng giữ giống (n m mốc Aspergillus oryzae) trên thạch nghiêng là mơi trƣờng
33
Hình 3.1 Mốc giống Aspergillus oryzae trên mơi trƣờng thạch nghiêng Quan sát dƣới kính hiển vi với độ phóng đại X40 hình ảnh sợi n m mốc Aspergillus Quan sát dƣới kính hiển vi với độ phóng đại X40 hình ảnh sợi n m mốc Aspergillus
oryzae sử dụng nuôi c y nhƣ thể hiện trên hình 3.2. Định kỳ hàng năm n m mốc
giống Aspergillus oryzae đƣợc công ty gửi giống đến trung tâm kiểm nghiệm Viện y tế công cộng TP. HCM (159 Hƣng Phú, phƣờng 8, quận 8, TP. Hồ Chí Minh) để kiểm tra độ thuần chủng của n m mốc và kết quả kiểm tra định kỳ 2 lần trong năm