oryzae sử dụng nuôi c y nhƣ thể hiện trên hình 3.2. Định kỳ hàng năm n m mốc
giống Aspergillus oryzae đƣợc công ty gửi giống đến trung tâm kiểm nghiệm Viện y tế công cộng TP. HCM (159 Hƣng Phú, phƣờng 8, quận 8, TP. Hồ Chí Minh) để kiểm tra độ thuần chủng của n m mốc và kết quả kiểm tra định kỳ 2 lần trong năm cho th y n m mốc giống Aspergillus oryzae sử dụng cho nghiên cứu này là thuần
chủng (chi tiết của kết quả kiểm nghiệm độ thuần chủng n m mốc giống xem phần phụ lục 7).
Hình 3.2 Mốc giống Aspergillus oryzae trên môi trƣờng PGA đĩa petri và dƣới kính hiển vi
34
Mốc giống từ các ống nghiệm đƣợc hòa với nƣớc c t đã đƣợc h p tiệt trùng và để nguội sau đó nhân giống sơ c p 1 bằng các hộp môi trƣờng nhƣ hình 3.3 (thành phần môi trƣờng trong các hộp nhƣ phụ lục 1), sau 24h nuôi c y trên môi trƣờng sơ c p 1 giống đƣợc chuyển sang nhân giống sơ c p 2 trên các khay nhƣ hình 3.4 với thành phần môi trƣờng nhƣ sơ c p 1 và đƣợc nuôi trong thời gian từ 48 – 72h thu đƣợc mốc giống sản xu t nhƣ hình 3.5
35
Hình 3.4 Mơi trƣờng nhân giống c p 2
Hình 3.5 Mốc giống sau 48 và 72 giờ nuôi c y
Quy trình nhân giống sản xu t của n m mốc Aspergillus oryzae đƣợc trình ày nhƣ hình 3.6
36
Hình 3.6 Quy trình nhân giống n m mốc Aspergillus oryzae c p 1 và c p 2 theo thời gian
A- Nhân giống c p 1 sau 24h; B- Nhân giống c p 2 sau 24h; C- Nhân giống c p 2 sau 48h; D- Nhân giống c p 2 sau 72h; E- Giống sản xu t
A B
C D
37
Độ ẩm là một yếu tố quan trọng trong q trình ni c y n m mốc mà thực ch t là hoạt độ nƣớc [20, 23]. Trong khảo sát này, độ ẩm môi trƣờng nhân giống sơ c p 1 và sơ c p 2 là 52% (đo ằng máy đo độ ẩm MB25 thuộc phịng NC&PTSP cơng ty cổ phần Nosafood) độ ẩm môi trƣờng nuôi c y n m mốc trong nghiên cứu này lớn hơn độ ẩm môi trƣờng dùng cho n m mốc Aspergillus oryzae 3.042 của J.Feng và
cộng sự [57] là 35%, sự khác biệt này có thể là do chủng loại n m mốc sử dụng khác nhau.
Mật độ tế bào nấm mốc Aspergillus oryzae trên 1g giống sản xuất 3.2.2
Quá trình xác định mật độ tế bào của giống sản xu t đƣợc tiến hành nhƣ sơ đồ quy trình hình 2.2, giống sản xu t đƣợc pha loãng đến các nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 và mật độ tế bào n m mốc đƣợc xác định nhƣ ảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả xác định mật độ tế bào n m mốc trên 1g giống sản xu t/mơi trƣờng PGA
Nồng độ pha lỗng 10-5 10-6 10-7
Lần 1 138 78 55
Lần 2 142 81 50
Lần 3 150 91 48
Mật độ tế bào n m mốc Aspergillus oryzae tính theo cơng thức (2-1) dùng để thực
hiện các khảo sát tiếp theo là 3×108
(CFU/g giống sản xu t).
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men nấm mốc Aspergillus oryzae 3.3
Xác định tỷ lệ nấm mốc Aspergillus oryzae sử dụng 3.3.1
Tiến hành khảo sát tỷ lệ giống mốc sản xu t ở các mức 0,5%, 1,0% và 1,5 % so với nguyên liệu đậu đen theo sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng qt hình 2.4. Kết quả khảo sát tỷ lệ n m mốc Aspergillus oryzae sử dụng so với nguyên liệu đậu đen đƣợc thể hiện nhƣ ảng sau:
38
Bảng 3.3 Tỷ lệ mốc giống sử dụng và hàm lƣợng protein hòa tan
Tỷ lệ nấm mốc Aspergillus oryzae (%) Mật độ tế bào giống (CFU) Hàm lƣợng protein hòa tan (%) 0,5 7,5×108 2,01a ± 0,63 1,0 15×108 2,92b ± 0,16 1,5 22,5×108 2,90b ± 0,09
(Số liệu trình bày dạng Mean ± SD, các chỉ số mũ a, b biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD ở mức độ tin cậy 95%).
Từ bảng 3.3 đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa tỷ lệ giống mốc sử dụng so với nguyên liệu đậu đen nghiên cứu đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.7
Hình 3.7 Đồ thị thể hiện tỷ lệ giống và hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc Từ bảng kết quả 3.3 và đồ thị hình 3.7, cho th y ở nồng độ n m mốc Aspergillus Từ bảng kết quả 3.3 và đồ thị hình 3.7, cho th y ở nồng độ n m mốc Aspergillus oryzae 1,0% so với nguyên liệu đậu đen cho hàm lƣợng protein hịa tan sau q trình lên men là cao nh t 2,92% và có sự khác biệt có ý nghĩa với nồng độ 0,5%; điều này trùng hợp với kết quả khảo sát của quy trình chuyển giao cơng nghệ của
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 0.5 1.0 1.5 Hàm lư ợ ng pr ote in hòa tan g/1 0 0 g Tỷ lệ giống (%)
39
Viện Công nghệ sinh học nhiệt đới cho công ty Nosafood áp dụng trên đối tƣợng là đậu nành [54].
Ở tỷ lệ giống 1,0% và 1,5% khơng có sự khác biệt có ý nghĩa vì hàm lƣợng protein hịa tan thu đƣợc ở 2 tỷ lệ giống này là gần nhƣ nhau. Do đó, vừa đảm bảo giá trị kinh tế vừa đảm bảo hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc cao nh t giữa các lần thí nghiệm nên tỷ lệ giống 1,0% đƣợc chọn cho thí nghiệm tiếp theo [54]. Theo kết quả phân tích ANOVA phần phụ lục 2 có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các tỷ lệ giống sử dụng với mức ý nghĩa 95% (p-value = 0,041 < 0,05).
Trong quá trình lên men đậu đen ằng n m mốc Aspergillus oryzae, n m mốc sẽ
phát triển trên môi trƣờng đậu và sinh ra enzyme protease, enzyme này sẽ thủy phân protein trong đậu thành các peptide và các acid amin mạch ngắn. Điều này giúp cho sau quá trình lên men và ủ dịch lên men hàm lƣợng protein hòa tan trong sản phẩm lên men tăng lên và phù hợp với nghiên cứu của J. Feng và cộng sự [57] trong nghiên cứu sự lên men của n m mốc Aspergillus oryzae trên đậu nành bằng phƣơng pháp bán rắn. Việc sản xu t enzyme protease từ n m mốc Aspergillus oryzae cũng đã đƣợc tiến hành trên cơ ch t hạt gạo bằng phƣơng pháp lên men án rắn nhƣ nghiên cứu của Jarun Chutmanop và cộng sự [58]. Trong nghiên cứu tác giả đã sử dụng hạt gạo Thái làm cơ ch t lên men để tạo ra enzyme protease. Kết quả khảo sát này giải thích cho việc ứng dụng n m mốc để lên men nguyên liệu đậu trong quá trình phát triển của n m mốc, n m mốc sẽ sinh ra enzyme protease và ứng dụng enzyme này để thủy phân protein đậu đen thành các acid amin.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của Kee-Jong Hong, Chan-Ho Lee và Sung Woo Kim đã thực hiện nghiên cứu “Lên men cải thiện ch t lƣợng dinh dƣỡng của đậu nành và các thực phẩm từ đậu nành ằng chủng n m mốc Aspergillus oryzae GB-107” [32], sau quá trình lên men bằng chủng n m mốc
Aspergillus oryzae GB-107 trên cơ ch t đậu nành và bột đậu nành thì hàm lƣợng
protein hòa tan tăng lên và các acid amin thiết yếu không đổi so với nguyên liệu đậu nành thơ.
40
Hình ảnh dịch đậu đen lên men với các tỷ lệ giống sản xu t 0,5%, 1,0% và 1,5% sau 15 ngày ủ đƣợc thể hiện nhƣ sau:
Hình 3.8 Hình ảnh dịch đậu đen lên men sau 15 ngày ủ với các tỷ lệ giống 0,5, 1,0 và 1,5% so với nguyên liệu đậu đen
Xác định nồng độ muối sử dụng 3.3.2
Tiến hành khảo sát nồng độ muối sử dụng thích hợp nhƣ trình ày ở sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng qt hình 2.4 và kết quả đƣợc thể hiện nhƣ bảng 3.4
Bảng 3.4 Nồng độ muối sử dụng
Nồng độ muối sử dụng (%) Hàm lƣợng protein hòa tan (%)
16 2,04a ± 0,57
18 2,96b ± 0,22
20 2,93b ± 0,16
Chú thích: Số liệu trình bày dạng Mean ± SD, các chỉ số mũ a, b biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD ở mức độ tin cậy 95%.
Từ kết quả số liệu bảng 3.4, đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ muối sử dụng và hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc sau quá trình lên men đƣợc thể hiện nhƣ đồ thị hình 3.9.
41
Hình 3.9 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ muối và hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc
Kết quả bảng 3.4 và hình 3.9, cho th y ở nồng độ muối sử dụng 18% thì hàm lƣợng protein hịa tan thu đƣợc là cao nh t 2,96% và có sự khác nhau có ý nghĩa giữa các nồng độ muối sử dụng số liệu thống kê xem phụ lục 3. Ở hai nồng độ muối sử dụng 18% và 20% khơng có sự khác nhau rõ rệt giữa hai hàm lƣợng protein hòa tan đƣợc thể hiện ở kết quả phân tích ANOVA nhƣ phụ lục 3. Theo nghiên cứu của Zhang Yanfang và cộng sự [59] trong quá trình lên men đậu nành để sản xu t nƣớc tƣơng bằng n m mốc Aspergillus oryzae thì enzyme protease do n m mốc tạo ra sẽ thủy phân protein của đậu nguyên liệu thô thành các acid amin. Theo nghiên cứu này ở nồng độ muối th p 15% sau 15 ngày lên men hàm lƣợng các amino acid đƣợc tạo ra cao là do các phản ứng hóa sinh trong q trình lên men đậu nành diễn ra tốt. Tuy nhiên, cũng theo nghiên cứu của Zhang Yanfang và cộng sự thì ở mức nồng độ muối cao thì vị và mùi của nƣớc tƣơng lên men sẽ tốt hơn so với ở mức nồng độ muối th p. Do đó, nồng độ muối 18% đƣợc xem là nồng độ thích hợp nên đƣợc cố định cho các khảo sát tiếp theo.
Hình ảnh dịch đậu đen lên men với tỷ lệ n m mốc 1,0% so với nguyên liệu đậu với các nồng độ dung dịch muối 16%, 18% và 20% sau 15 ngày ủ đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.10. 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 16.0 18.0 20.0 Hàm lư ợ ng pr ote in hịa tan g/1 0 0 g Nồng độ muối (%)
42
Hình 3.10 Hình dịch đậu đen lên men sau 15 ngày ủ với tỷ lệ giống 1,0% so với nguyên liệu đậu với các nồng độ dung dịch muối 16, 18 và 20%
Xác định thời gian ủ dịch đậu đen lên men sau cấy nấm mốc 3.3.3
Khảo sát thời gian ủ dịch đậu đen sau khi c y n m mốc đƣợc tiến hành nhƣ sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát hình 2.4 và kết quả đƣợc thể hiện nhƣ bảng 3.5.
Bảng 3.5 Thời gian ủ và hàm lƣợng protein thu đƣợc
Thời gian ủ (ngày) Hàm lƣợng protein hòa tan (%)
15 2,02a ± 0,76
30 4,44b ± 0,48
45 4,48b ± 0,48
Chú thích: Số liệu trình bày dạng Mean ± SD, các chỉ số mũ a, b biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD ở mức độ tin cậy 95%.
43
Từ kết quả số liệu bảng 3.5, đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa thời gian ủ dịch đậu đen sau lên men với hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc đƣợc thể hiện nhƣ đồ thị hình 3.11:
Hình 3.11 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa thời gian ủ và hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc trong quá trình lên men
Kết quả bảng 3.5 và hình 3.11, cho th y ở các khoảng thời gian ủ 15 ngày, 30 ngày và 45 ngày có sự khác biệt về hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê theo phân tích ANOVA phụ lục 4 (p-value = 0,0032 < 0,05). Tuy nhiên, ở các khoảng thời gian ủ 30 ngày và 45 ngày khơng có sự khác biệt về hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc 4,44% (ở 30 ngày ủ) và 4,48% (ở 45 ngày ủ) vì vậy mức thời gian 30 ngày ủ là mức thời gian tối thiểu đƣợc chọn để áp dụng trong sản xu t [54], đáp ứng đƣợc yêu cầu về kinh tế cũng nhƣ giá trị protein hòa tan thu đƣợc trong sản phẩm. Trong quá trình ủ lên men enzyme protase đƣợc sản sinh bởi n m mốc sẽ tiến hành thủy phân cắt mạch protein trong nguyên liệu đậu đen thành các amino acid theo công bố của Zhang Yanfang và cộng sự [59]. Qua q trình nghiên cứu chúng tơi có nhận xét về tƣơng ủ nhƣ sau: thời gian ủ chín sau lên men cho sản phẩm đƣợc lên men bằng phƣơng pháp vi sinh vật càng kéo dài thì ch t lƣợng về cảm quan (mùi) sẽ tốt lên nhƣng không để quá lâu, và phù hợp với kết luận của tác giả Đồng Thị Thanh Thu [52].
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 15.0 30.0 45.0 H àm lư ợ ng pr o tei n hị a ta n g/ 10 0g
44
Hình ảnh dịch đậu đen lên men sau các khoảng thời gian ủ 15, 30 và 45 ngày đƣợc thể hiện nhƣ sau:
Hình 3.12 Hình dịch đậu đen lên men với tỷ lệ giống 1,0% so với nguyên liệu đậu đen, nồng độ muối 18% đƣợc ủ với thời gian 15, 30 và 45 ngày
Sản xuất sản phẩm tƣơng đen (Hoisine sauce) giàu protein 3.4
Sử dụng kết quả các thí nghiệm về xác định tỷ lệ giống ni c y (kết quả thí nghiệm 1), xác định nồng độ muối sử dụng (kết quả thí nghiệm 2) và xác định thời gian ủ dịch đậu lên men sau c y mốc (kết quả thí nghiệm 3); chúng tôi tiến hành lên men đậu đen theo quy trình sản xu t tƣơng đen đƣợc trình ày nhƣ sơ đồ hình 2.5, với các thơng số cụ thể nhƣ sau:
Khối lƣợng đậu đen sử dụng: 500g.
Tỷ lệ giống sản xu t sử dụng: 5g (1%/khối lƣợng nguyên liệu đậu đen).
Khối lƣợng dung dịch muối 18%: 600g.
Thời gian ủ dịch đậu đen lên men: 30 ngày.
Dịch đậu đen lên men sau khi ủ 30 ngày đƣợc sử dụng để sản xu t tƣơng đen (Hosine sauce) với thành phần nguyên liệu đƣợc thể hiện nhƣ bảng 3.6.
Sản phẩm tƣơng đen (Hoisine sauce) sau quá trình sản xu t đƣợc tiến hành đo OD ở ƣớc sóng 595nm thu đƣợc kết quả nhƣ ảng 3.7
45
Bảng 3.6 Thành phần nguyên liệu sản xu t tƣơng đen (Hoisine sauce)
STT Nguyên liệu Thành phần (% theo khối lƣợng)
1 Dịch đậu đen lên men 60,00%
2 Đƣờng 17,32% 3 Bột ngọt 2,00% 4 Tỏi 5,00% 5 Muối 2,16% 6 Tinh ột iến tính 2,16% 7 Acid acetic 0,43% 8 Nƣớc 10,92 %
Sau quá trình lên men đậu đen và ứng dụng dịch đậu đen để sản xu t tƣơng đen (Hoisine) chúng tơi đã thu đƣợc dịng sản phẩm tƣơng đen có ch t lƣợng với hàm lƣợng protein hòa tan trong sản phẩm tƣơng đối cao 3,38% theo khối lƣợng. Hàm lƣợng protein tổng trong mẫu tƣơng đen (Hoisine sauce) đƣợc sản xu t từ dịch đậu đen lên men trong nghiên cứu này đƣợc kiểm nghiệm tại trung tâm sắc ký Hải Đăng với kết quả thu đƣợc là 4,07% (kết quả kiểm nghiệm xem phụ lục 7).
Bảng 3.7 Kết quả OD595nm và hàm lƣợng protein hòa tan tƣơng ứng của sản phẩm tƣơng đen (Hoisine sauce)
Lần đo OD595nm Hàm lƣợng protein hòa tan (%)
1 0,275 3,34
2 0,281 3,47
46
Hàm lƣợng protein hòa tan trong sản phẩm tƣơng đen (Hoisine sauce) tính đƣợc nhƣ sau: 3,38 ± 0.10 (g/100g) (kết quả thể hiện dạng mean ± SD).
Tóm lại, với mục tiêu nghiên cứu an đầu đề ra là ứng dụng đậu đen lên men để sản xu t tƣơng đen (Hoisine) với hàm lƣợng protein cao, từ 500g nguyên liệu đậu đen an đầu qua quá trình ni c y bằng n m mốc Aspergillus oryzae chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Tỷ lệ mốc giống sản xu t sử dụng 1%/nguyên liệu đậu đen.
Nồng độ muối sử dụng: 18%.
Thời gian ủ dịch đậu đen sau lên men: 30 ngày.
Hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch ủ đậu đen là 4,44 ± 0,48 (g/100g).
Hàm lƣợng protein hòa tan của tƣơng thành phẩm đạt 3,38 ± 0,10 (g/100g).
Đánh giá tính chất hóa lý của tƣơng đen thành phẩm từ đậu đen so với 3.5
tƣơng thành phẩm từ đậu nành
Đo màu tương thành phẩm và đậu lên men 3.5.1
Có nhiều hệ màu dùng để xác định độ màu trong phân tích sản phẩm thực phẩm [60] nhƣ hệ màu Munsell, hệ màu CIE, hệ màu CIE L*a*b* (CIELAB), hệ màu Hunter lab, hệ màu Lovibond, tuy nhiên theo nghiên cứu của Atsushi Miyagi và cộng sự [61] về việc sử dụng không gian màu CIELAB trong việc xác định độ màu của nƣớc tƣơng phù hợp với nghiên cứu của luận văn này nên hệ màu CIELAB đƣợc chọn để đo màu cho đậu đen lên men và tƣơng thành phẩm từ đậu đen lên