- Chọn cây biểu hiện gen chuyển nạp (cây chuyển gen)
4.2. Chuyển nạp trực tiếp
Hệ vec tơ thơng qua vi khuẩn Agrobacterium chỉ có hiệu quả cao ở một số loài cây hai lá mầm. Các cây trồng kinh tế chắnh, ựặc biệt các loại cây cốc và nhiều loại ựậu ựỗ ắt hoặc không phù hợp với chuyển nạp thông qua Agrobacterium. Nhiều cố gắng ựã ựược
tiến hành ựể phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp vào tế bào không thông qua kắ chủ trung gian.
Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.126 Chuyển gen thông qua Polyethylene glycol (PEG): Ban ựầu PEG ựược sử dụng trong dung hợp tế bào rồi sau ựó ựược phát triển thành kỹ thuật ựơn giản ựể chuyển nạp di truyền. PEG 6000 ở nồng ựộ 15-20% giảm thiểu tác ựộng ựẩy nhau giữa ADN và màng tế bào và bảo vệ ADN khỏi hoạt tắnh phân giải của nucleaza. PEG kắch thắch sự hấp thụ của tế bào ựối với các phần tử nhỏ tách rời như lục lạp, liposom hay vi khuẩn. Do ựó PEG làm kết tủa ADN của plasmid lên màng tế bào tạo ựiều kiện ựể ADN xâm nhập vào tế bào.
Chắch ựiện (electroinjection hay electroporation): Chắch ựiện là áp dụng xung ựiện có hiệu ựiện thế cao lên tế bào trần ựể tạo ra khe hở nhất thời ở màng tế bào làm cho các ựại bào tử như ADN có thể xâm nhập vào tế bào. Thời gian và cường ựộ xung ựiện ựược ựiều chỉnh sao cho tế bào sống sót và hấp thụ ADN một cách toả ựáng. Phương pháp này dễ lặp lại hơn so với phương pháp PEG và ựược sử dụng ựể tạo ra các tế bào và cây chuyển gen ở các loài, chẳng hạn ở lúa.
Phương pháp bắn hạt (microprojectile bombardment): Hạt vàng hay won-fram, ựường kắnh 1-4 ộm bọc ADN, ựược kết tủa với CaCl2, spermidine hoặc PEG. Hạt bọc ADN ựược tăng tốc (300-600 m/s) bằng một thiết bị ựặc biệt gọi là máy bắn hạt. Với tốc ựộ này hạt xâm nhập qua thành và màng tế bào. Mật ựộ hạt sử dụng phải ựược ựiều chỉnh sao cho không làm tổn thương tế bào.
Những cây trồng ựã áp dụng thành công phương pháp bắn gen là ựậu tương, bông, ựu ựủ, ngô, lúa nước, lúa mì, mắa, cao lương, vv. Phương pháp này cũng ựược sử dụng ựể chuyển gen vào lạp thể và ti thể.
Phương pháp vi chắch: Dùng micropipet hay xylanh nhỏ ựể ựưa trực tiếp ADN vào tế bào trần.