Tuy nhiên, trong khuôn khổ chương này chúng tôi chỉ thảo luận một số kỹ thuật nuôi cấy in
vitro liên quan trực tiếp tới quá trình chọn giống.
2.1. Ni cấy phơi, ni cấy nỗn và thụ phấn in vitro
Các nhà chọn giống chủ yếu ựã và ựang tận dụng biến dị di truyền hiện có trong trong nguồn gen trồng trọt bằng cách sử dụng nhiều sơ ựồ lai và chọn lọc khác nhau. Tuy nhiên với thâm canh và ựộc canh một ắt kiểu gen chọn lọc về những tắnh trạng có ý nghiã kinh tế biến dị di truyền ngày một giảm trong nguồn gen trồng trọt. Thậm chắ trong một số trường hợp biến dị ựối với một số tắnh trạng có ý nghĩa kinh tế khơng cịn thoả ựáng hay thiếu hoàn toàn, vắ dụ tắnh kháng bệnh vàng lụi, sâu ựục thân, chịu mặn ở lúa, sâu hồng ựục quả bông, và bệnh khảm vàng ở ựậu xanh.
để khắc phục những yếu tố ảnh hưởng ựến năng suất, nhà chọn giống cần nguồn di truyền hay nguồn gen ựề kháng từ các lồi hoang dại thân thuộc hay khơng thân thuộc. Một khó khăn lớn khi sử dụng các lồi hoang dại ựể lai với cây trồng là tắnh bất hợp khi lai. Trong một số trường hợp phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các lồi có quan hệ xa nhau thường yếu và khơng có khả năng sống do sự cung cấp dinh dưỡng của nội nhũ không ựầy ựủ. Những phôi như vậy thường bị chết trong một thời gian ngắn sau khi hình thành hợp tử và khơng thể phát triển thành hạt có khả năng sống. Vì vậy ni cấy phôi hay cứu phôi là một phương pháp ựể khắc phục hàng rào bất hợp, bảo ựảm ựể phôi non sinh trưởng, nảy mầm, và phát triển thành cây con. Thông qua sử dụng phương pháp này người ta ựã tạo ra nhiều con lai khác loài ở nhiều loại cây trồng như lúa mì, lúa nước, ựại mạch, bơng, ựậu ựỗ, các lồi cây ăn quả và cây cảnh và nhờ vậy nhiều gen có ắch ựã ựược chuyển vào cây trồng.
Nỗn ựã thụ tinh ựơi khi ựược nuôi cấy ựể cứu phôi từ các tổ hợp lai xa mà không cần tách phôi ra khỏi nỗn. Nỗn chứa phơi lai non ựược tách ngay sau khi thụ tinh trong ựiều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Bằng con ựường nuôi cấy nỗn phơi có thể ni cấy ở giai ựoạn sớm hơn so với nuôi cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phơi phát triển trong nỗn có mơi trường hố học và lý học thuận lợi hơn phôi nuôi cấy bên ngồi nỗn.
Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu thập noãn chưa thụ tinh, cấy noãn trên môi trường dinh dưỡng trong ựiều kiện vô trùng, và thụ phấn cho noãn với các hạt phấn tươi. Ống phấn xun qua thành nỗn vào túi phơi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng. Phương pháp này ựã ựược áp dụng ựể tạo con lai giữa các lồi mà ống phấn khơng thể sinh trưởng và xun vào nỗn bình thường sau khi thụ phấn.
2.2. Ni cấy bao phấn và sản xuất cây ựơn bội
Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc tạo giống mới cải tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F2 lớn và chọn lọc các dòng mong muốn trong các thế hệ phân ly từ F2 ựến F7 ựể cuối cùng tạo ra các dịng ựồng hợp tử. Ni cấy bao phấn hay hạt phấn là
Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.121 một kỹ thuật hữ hiệu ựể tạo ra các dòng ựồng hợp tử ngay từ thế hệ ựầu tiên (dịng ựơn bội kép), do ựó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết ựể tạo ra giống mới.
Nuôi vấy bao phấn là nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng ựể tạo ra cây ựơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây ựơn bội ựược nhân ựôi ựể tạo ra cây lưỡng bội ựồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể ựơn bội kép. Ni cấy bao phấn có ắch ựối với nhà chọn giống vì thể ựơn bội kép có thể ựược sử dụng ngay làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Thời gian cần thiết ựể tạo ra một giống hay một dòng tự phối bằng phương pháp ựơn bội kép ựược rút ngắn nhiều thế hệ so với phương pháp truyền thống ựể ựạt ựộ ựồng hợp tử bằng tự thụ phấn. Các dòng ựơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất ựể cải tiến hiệu quả chọn lọc ựối với nhiều tắnh trạng vì trong quần thể khơng có phương sai trội, ựồng thời gen lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này ựã ựược áp dụng thành công ở Trung Quốc trong việc tạo ra các giống lúa nước và lúa mì. Tuy nhiên hạn chế trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả năng ni cấy khó và tắnh ựặc thù cao của kiểu gen. Vắ dụ, các nhà chọn giống lúa Indica không thể sử dụng kỹ thuật này có hiệu quả bằng các nhà chọn giống lúa Japonica do các kiểu gen Indica khó ni cấy. Ngồi ảnh hưởng của lồi và kiểu gen trong loài, khả năng tạo ựơn bội bằng con ựường ni cấy bao phấn/hạt phấn cịn bị ảnh hưởng bởi giai ựoạn phát triển của bao phấn, ựiều kiện sinh lý của cây cho phấn, ựiều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, ựiều kiện ni cấy và hiệu quả lưỡng bội hố bằng colchicine.
2.3. Biến dị dịng xơ ma và chọn lọc dịng tế bào
Ban ựầu ni cấy mơ ựược sử dụng làm kỹ thuật mới ựể tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng ựể sản xuất hàng loạt cây ựồng nhất và như bố mẹ ban ựầu của các giống ưu tú.
Tuy nhiên, với thời gian và các cơng trình nghiên cứu ở nhiều lồi cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô ựược nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến ựổi di truyền bao gồm sự thay ựổi về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể, sự xắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, ựột biến gen, hoạt hóa các gen di ựộng, vv. Các biến dị này ựược truyền cho cây khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do q trình ni cấy ựược gọi là biến dị dịng xơ ma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Biến dị dịng xơ ma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gen trong lồi và mơ cấy, chế ựộ ni cấy (thời gian cấy chuyền, ựiều kiện lý học của môi trường, thành phần môi trường...) thời gian nuôi cấy in vitro, và tắnh ổn ựịnh của genom. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các kiểu gen ựã thắch ứng rất có ắch cho sự cải lương giống cây trồng. Một số thể biến dị dịng xơ ma có ắch ựã ựược phân lập, ựó là khả năng ựề kháng virut Fiji và bệnh ựốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mắa (Heinz và cộng sự, 1977); khả năng kháng bệnh ựốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); khả năng kháng sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); và khả năng chịu hạn và lạnh ở lúa (Lê Trần Bình và cộng sự, 1996) .
Một ưu ựiểm quan trọng của biến dị di truyền trong q trình ni cấy là khả năng chọn lọc dịng tế bào in vitro. Có thể ni cây và xử lý hàng triệu tế bào trong một không gian hạn chế, chẳng hạn trong ựĩa pe tri và chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy ựiều kiện bất lợi gọi là tác nhân chọn lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý ựột biến trong nuôi cấy ựể tăng tần số biến dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tắnh trạng biểu hiện ở mức tế bào mới có thể xác ựịnh ựược bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm các ựặc tắnh như kháng thuốc trừ cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt hay nhôm, a xit amin tương ựồng, chịu
Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.122 nhiệt ựộ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả năng kháng ựộc tố tạo ra do các tác nhân gây bệnh. Các kiểu gen phân lập kháng với các ựiều kiện bất lợi này có thể ựược sử dụng trực tiếp trong chương trình chọn giống. Tắnh trạng số lượng di truyền phức tạp như năng suất, khả năng chống ựổ hay chất lượng ắt thắch hợp với chọn lọc ở mức tế bào.
Chọn lọc dòng tế bào in vi tro bao gồm các bước sau:
1) Nuôi cây tế bào từ một kiẻu gen ựã thắch nghi nhưng có nhược ựiểm ở một tắnh trạng nhất ựịnh và cần ựược cải tiến, nhất ựịnh và cần ựược cải tiến,
2) Xử lý tế bào nuôi cấy bằng tác nhân chọn lọc thắch hợp nhằm ức chế sinh trưởng của mọi tế bào, trừ tế bào có khả năng ựề kháng, mọi tế bào, trừ tế bào có khả năng ựề kháng,
3) Tái sinh cây từ các tế bào sống sót.
Các tế bào có thể tiếp xúc với tác nhân chọn lọc thông qua nuôi cấy ở các nồng ựộ hay mức khác nhau của tác nhân chọn lọc. Có thể xử lý tế bào trong nuôi cấy huyền phù ựồng nhất hơn nhiều so với tế bào trong nuôi cấy callus. Tế bào sống sót ựược chuyển sang mơi trường tái sinh ựể chồi và rễ phát triển. Các ựặc tắnh biểu hiện trong nuôi cấy tế bào phải biểu hiện ở cây tái sinh. Ở cây sinh sản bằng hạt ựặc tắnh phải biểu hiện không ựổi ở các thế hệ sinh sản hữu tắnh của cây tái sinh. Chọn lọc các dòng chống chịu trên ựồng ruộng rất cần thiết ựể thẩm tra tắnh di truyền khả năng chống chịu ựã chọn ở mức tế bào.
3. Dung hợp tế bào trần
Trong các phương pháp chọn tạo giống truyền thống lai hữu tắnh là phương pháp cơ bản nhất ựể tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử. Tuy nhiên lai hữu tắnh chỉ thực hiện ựược giữa các cá thể trong một lồi hay các lồi có quan hệ thân thuộc. Lai giữa các lồi có quan hệ xa nhau thường rất khó khăn và hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tắnh hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguồn biến dị di truyền cần thiết cho việc cải lương cây trồng. Vì vậy một phương pháp mới ựược ựề xuất từ năm 1973(Keller và Melchers, 1973) ựể khắc phục hàng rào lai hữu tắnh giữa các lồi có quan hệ họ hàng xa nhau là phương pháp dung hợp tế bào xô ma hay dung hợp tế bào trần.
Dung hợp tế bào trần là sự hợp nhất của các tế bào xơ ma khơng có thành tế bào của các cá thể hoặc các loài khác nhau và sau ựó tái sinh cây lai từ các tế bào ựã dung hợp. Trong lai hữu tắnh, các tắnh trạng do ADN của cơ quan tử kiểm sốt hồn tồn giống cây mẹ vì khơng có sự tổ hợp các cơ quan tử của bố và mẹ. Trong dung hợp tế bào trần , ngoài khả năng dung hợp nhân, cịn có khả năng xảy ra hỗn hợp tế bào chất, hình thành tổ hợp di truyền hoàn toàn mới. Ti thể và lạp thể của hai tế bào khác nhau có thể hợp nhất hoặc/và tái tổ hợp tạo ra một tế bào dị tế bào chất, gọi là cybrid. Như vậy, bằng con ựường lai xơma người ta có thể thu ựược tổ hợp mới của lạp thể hay/và ti thể và tương tác mới giữa nhân và tế bào chất.
Dung hợp tế bào trần là một quá trình nhiều giai ựoạn, bao gồm việc phân lập tế bào trần từ các loài khác nhau, dung hợp tế bào trần của hai loài khác nhau, giám ựịnh và nhân sản phẩm dung hợp và cuối cùng là tái sinh cây lai hữu dục từ sản phẩm dung hợp.
Trước khi tế bào xôma dung hợp phải loại bỏ thành tế bào ựể tạo ra tế bào trần. Tế bào thịt lá, rễ, thân mầm và các loại mô khác hoặc tế bào trong nuôi cấy huyền phù ựược xử lý với các enzym phân giải thành tế bào ựể thu nhận tế bào trần. Yếu tố hạn chế cơ bản trong việc ứng dụng rộng rài lai xơma là khó tái sinh cây từ protoplast và khơng có khả năng sử dụng một cách có chọn lọc các phần nhỏ genom của một loài ựế kết hợp với lồi kia (Vasil, 1990).
Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội Ờ Giáo trình Chọn giống cây trồngẦẦẦẦ.Ầ..ẦẦẦẦẦ.123 Lai xơma ựược sử dụng có hiệu quả ựể kết hợp khả năng kháng các bệnh virut ở khoai tây từ các kiểu gen trong một loài cũng như từ các lồi khác nhau (Wenzel, 1994). Lai xơma là một phương tiện có hiệu quả ựẻ chuyển bất dục ựực tế bào chất và ựa dạng hoá nguồn bất dục trong việc tạo giống lai.
3.1. Dung hợp tế bào và sự phát triển của sản phẩm dung hợp
Tế bào thực vật tắch ựiện âm và ựẩy nhau cản trở quá trình dung hợp tự phát. Vì thế bước ựầu tiên ựể kết dắnh tế bào là làm cho chúng tiếp xúc với nhau, qua ựó tạo ra cầu nối tế bào chất giữa hai tế bào trần. Lần ựầu tiên vào năm 1973 Keller và Melchers ựã ựề xuất phương pháp dung hợp nhờ chất hoá học. Ngày nay phần lớn người ta sử dụng tác nhân dung hợp là hỗn hợp polyethylene glycol, nitrat canxi và dimethylfoxid.
Một phương pháp khác rất có hiệu quả, nhất là ựối với cây họ cà, là dung hợp bằng ựiện. Trước tiên tế bào trần ựược tiếp xúc với nhau thông qua trường ựiện xoay chiều không ựồng nhất giữa hai ựiện cực. Sau ựó q trình dung hợp sẽ diễn ra thông qua xung ựiện của dịng ựiện một chiều có ựiện thế cao (500-2000 V/cm) trong khoảng thời gian cực ngắn (1 - 50 ộs - micro giây).
Trong sản phẩm dung hợp, sự dung hợp nhân thường không diễn ra ngay mà diễn ra trong vài ngày. Hai nhân cũng có thể hợp nhất vào thời ựiểm của lần phân bào nguyên nhiễm ựầu tiên. Nhiễm sắc thể của hai nhân cùng một lúc tạo ra ựĩa trung kỳ và dung hợp nhân xảy ra vào kỳ cuối. Cũng có thể một nhân phân chia nguyên nhiễm còn nhân thứ hai bị mất ựi tạo nên cây có kiểu nhân giống với một trong hai bố mẹ.
Trong quá trình phân bào sau khi dung hợp, các cơ quan tử trong tế bào dị nhân có thể phân ly, ựào thải hay tái tổ hợp tạo thành các dạng con lai khác nhau (Hình 8 - 1).
Nếu mục ựắch chỉ kết hợp nhân của một loài với toàn bộ tế bào chất của loài kia, người ta xử lý loài cho tế bào chất bằng tia X hoặc tia gamma và xử lý lồi kia với hố chất như iodoacetate hoặc iodoacetamide ựể loại trừ các cơ quan tử trước khi dung hợp. Phương pháp này gọi là phương pháp Ộthể cho Ở thể nhậnỢ (Galun và Aviv, 1986).
3.2. Chọn lọc sản phẩm dung hợp
Khi hỗn tế bào trần của hai lồi bố mẹ trong mơi trường dung hợp sẽ thu ựược 5 loại tế bào trần khác nhau: Những tế bào không dung hợp có kiểu nhân giống bố và mẹ; sản phẩm dung hợp hình thành do dung hợp tế bào trần của bố hoặc mẹ (sản phẩm dung hợp ựồng nhân); sản phẩm lai tế bào xơ ma hình thành do dung hợp của tế bào trần bố và mẹ (sản phẩm dung hợp dị nhân). Tỉ lệ sản phẩm dung hợp hay con lai tế bào xô ma thường thấp phụ thuộc vào loài cây bố mẹ, tắnh tương hợp của chúng và phương pháp dung hợp. Một khó khăn trong việc phân lập con lai tế bào xô ma là phương tiện ựể giám ựịnh con lai (sản phẩm dung hợp) và tách chúng ra khỏi hỗn hợp các tế bào trần.
Về cơ bản có 3 phương pháp ựược sử dụng ựể tách sản phẩm dung hợp. Phương pháp thứ nhất dựa vào khả năng nhận biết tế bào lai ngay sau khi dung hợp. Tế bào trần của một bố mẹ khơng có chlorophyll (diệp lục) dung hợp với tế bào trần chứa chlorophyl của bố mẹ kia. Sản phẩm dung hợp (một nửa có màu xanh) có thể phân biệt và chọn lọc nhờ kắnh hiển vi. Cũng có thể chỉ thị tế bào trần bằng chất màu huỳnh quang rồi cho dung hợp và chọn tế bào lai bằng máy phân loại tế bào (Galbrath, 1984).
Phương pháp thứ hai dựa vào khả năng kháng kép của con lai xôma với các chất