Nhuộm Gram là một phương pháp nhằm phân biệt 2 nhĩm vi khuẩn: Gram dương và Gram âm dựa trên các đặc tính hố lý và cấu tạo của thành tế bào vi khuẩn. Ở vi khuẩn Gram dương, thành tế bào cĩ một lớp peptidoglycan dày, chất này cĩ khả năng giữ phức hợp tím tinh thể của thuốc nhuộm tím violet. Từ đĩ
làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể-violet bên trong tế bào và tế bào cĩ màu tím xanh.
Trong khi đĩ, ở vi khuẩn gram âm, lớp thành tế bào peptidoglycan mỏng hơn và đặc biệt cĩ thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngồị Sau khi nhuộm với dung dịch tím violet, mẫu được xử lý tiếp với ethanol 95%. Dung mơi này sẽ phá vỡ lớp đơi phospholipid của thành ngồi và các tinh thể của dung dịch tím violet cũng bị rữa trơị Do đĩ khi nhuộm thuốc nhuộm thứ hai, thành tế bào vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu và cĩ màu đỏ hồng của Fuchsin.
Dựa vào nguyên tắc nhuộm trên, tiến hành nhuộm Gram chủng vi khuẩn nghiên cứu xác định tính Gram, một trong những tiêu chí phân loại vi khuẩn.
Sau khi nhuộm, chủng vi khuẩn T5 bắt màu đỏ hồng.
Như vậy: chủng vi khuẩn sinh IAA (T5) được khảo sát là vi khuẩn Gram âm.
Hình 3.10. Tế bào vi khuẩn T5 nhuộm Gram âm
3.3.3. Hoạt tính catalase của vi khuẩn chủng T5
Đây là đặc điểm của vi sinh vật hiếu khí. Vi sinh vật kỵ khí bắt buộc và nhiều loại vi sinh vật ưa khí khơng sinh ra catalasẹ
Catalase phân hủy H2O2 tạo thành O2 theo phản ứng sau đây: H2O2 H2O + O2
Hoạt tính catalase được phát hiện bằng cách cho một giọt dung dịch H2O2 30% lên vi khuẩn, dựa vào hiện tượng sủi bọt (+) hay khơng (-) và kết luận hoạt tính catalase của chủng.
3.3.4. Khả năng cố định nitơ phân tử của vi khuẩn chủng T5
Khả năng cố định đạm là một trong những đặc điểm của một nhĩm vi khuẩn sinh IAA và được dùng làm chỉ tiêu để khảo sát.
Các vi sinh vật cố định nitơ phân tử phát triển tốt trên mơi trường Ashby là mơi trường vơ đạm. Thí nghiệm tiến hành cấy chủng vi khuẩn T5 lên mơi trường Ashby trong 7 ngàỵ Những khuẩn lạc đơn mọc được trên mơi trường được hình thành từ những tế bào vi khuẩn cĩ khả năng sử dụng nitơ phân tử của khơng khí. Tuy nhiên, một số vi sinh vật vi đạm, tức cĩ nhu cầu nitơ cực thấp, cĩ thể sử dụng được một lượng nhỏ nitrogen liên kết chứa trong các hĩa chất, nước máy, trong khơng khí.
Để loại trừ khả năng vi đạm của chủng T5, thí nghiệm tiếp tục cấy trãi liên tiếp vi khuẩn T5 sau khi thu khuẩn lạc đơn lên mơi trường Ashbỵ Kết quả qua các lần cấy trãi, vi khuẩn T5 đều phát triển tốt trên mơi trường vơ đạm. Đồng thời căn cứ vào mức độ phát triển cĩ thể kết luận vi khuẩn T5 cĩ khả năng cố định nitơ phân tử.
3.3.5. Xác định đường cong sinh trưởng của vi khuẩn T5
Vi khuẩn T5 được nuơi cấy trong mơi trường Nfb sẽ sinh trưởng, phát triển làm tăng số lượng tế bào trong dung dịch. Sử dụng máy quang phổ để đo độ đục dung dịch nuơi cấy vi khuẩn ở bước sĩng 610nm. Độ đục càng cao chứng tỏ nồng độ vi khuẩn trong dung dịch càng lớn, vi khuẩn sinh trưởng mạnh. Dựa vào chỉ số OD610nm, đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn T5. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.14.
Kết quả được sử dụng để xây dựng đường cong sinh trưởng của đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn sinh IAA chủng T5. Nhìn chung, sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn được xác định gồm 4 pha:
- Pha tiềm phát: số lượng tế bào vi khuẩn tăng khơng đáng kể, chủ yếu xảy ra mạnh mẽ quá trình sinh tổng hợp protein, enzyme, ADN.
- Pha log: số lượng tế bào vi khuẩn trong dung dịch tăng theo hệ số mũ ( N= N0 2vt).
- Pha ổn định: số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi do đĩ tổng số tế bào của dung dịch nuơi cấy khơng tăng.
- Pha suy vong: số tế bào sinh ra thấp hơn số tế bào chết do mơi trường cạn chất dinh dưỡng, tạo ra những yếu tố bất lợi cho vi sinh vật. Nên số tế bào trong mơi trường nuơi cấy giảm.
Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn sẽ biểu thị các giai đoạn trên của vi khuẩn trong quá trình nuơi cấỵ Mỗi vi khuẩn cĩ một đường cong sinh trưởng riêng, phụ thuộc chủ yếu vào đặc điểm của chủng giống. Dựa vào đường cong sinh trưởng sẽ xác định thời gian nuơi cấy vi khuẩn để thu sinh khối hiệu quả nhất.
Ở biểu đồ 3.1, giai đoạn tiềm phát diễn ra rất ngắn trong 1 ngày vì vi khuẩn T5 đã được nuơi cấy trong mơi trường Nfb, mơi trường chủ yếu sử dụng trong quá trình nghiên cứụ
Pha log của vi khuẩn T5 kéo dài từ 1 đến 6 ngày, vi khuẩn sinh sản rất nhanh thể hiện qua chỉ số đo OD610nmbiến động từ 0,103 - 0,797.
Pha cân bằng bắt đầu từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 sau nuơi cấy, chỉ số đo OD biến động rất nhỏ: 0,627 - 0,797. Cĩ nhiều nguyên nhân làm cho quần thể vi khuẩn chuyển sang giai đoạn ổn định. Trong đĩ nguyên nhân chủ yếu là do sản phẩm của quá trình trao đổi chất tạo ra những yếu tố bất lợi trong mơi trường làm hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn [8].
Theo kết quả trên, thời gian nuơi cấy vi khuẩn T5 thích hợp trong mơi trường lỏng Nfb để tăng sinh khối mạnh từ 6 - 8 ngàỵ
Bảng 3.14. Sự biến động OD610nm của dung dịch nuơi cấy vi khuẩn T5 theo thời gian
Thời gian
theo dõi (ngày) Chỉ số OD610nm
Thời gian (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
theo dõi (ngày) Chỉ số OD610nm
0 0,054 7 0,776 1 0,103 8 0,770 2 0,171 9 0,627 3 0,266 10 0,496 4 0,318 11 0,324 5 0,707 12 0,252 6 0,797 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Thời gian theo dõi (ngày)
C h ỉ số O D ( 61 0n m ) OD
Biểu đồ 3.1. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn chủng T5
3.3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn chủng T5 chủng T5
Sinh trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn liên quan chặc chẽ với các điều kiện của mơi trường bên ngồi, bao gồm hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác động qua lại với nhaụ Các yếu tố bên ngồi ảnh hưởng đến vi khuẩn như nhiệt độ pH, liều lượng tia chiếu UV, thành phần hĩa học của mơi trường, độ nhớt, ... .
Hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn cĩ thể coi là kết quả của các phản ứng hĩa học. Các phản ứng phụ thuộc chặc chẽ vào nhiệt độ. Vì vậy yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bàọ Tế bào thu được nhiệt chủ yếu từ mơi trường bên ngồi, một phần do cơ thể thải ra qua hoạt động trao đổi chất. Do đĩ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các mức nhiệt độ: 25, 32, 39, 460C đến sinh trưởng của vi khuẩn nhằm chọn ra nhiệt độ thích hợp để nhân nuơi sinh khốị
Tiến hành đo OD610nm của dung dịch nuơi cấy sau 0, 2, 4, 6, 8, 10 ngày để đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn. Kết quả được ghi nhận qua bảng 3.15.
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của vi khuẩn sinh IAA Thời gian
theo dõi (ngày)
Kết quả đo OD610 của chủng vi khuẩn sinh IAA 250C 320C 390C 460C 0 0,054 0,053 0,054 0,055 2 0,072 0,186 0,110 0,085 4 0,204 0,315 0,301 0,201 6 0,515 0,788 0,590 0,317 8 0,506 0,685 0,548 0,306 10 0,346 0,481 0,395 0,214 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 2 4 6 8 10
Thời gian theo dõi (ngày)
C h ỉ số đ o O D ( 61 0n m ) 25 độ C 32 độ C 39 độ C 46 độ C
Ở nhiệt độ 320C, chủng vi khuẩn T5 sinh trưởng mạnh nhất. Nhiệt độ 250C và 390C vi khuẩn sinh trưởng kém. Nhiệt độ 460C vi khuẩn sinh trưởng rất kém do làm biến tính enzyme, protein [8]. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng hoặc làm chết vi khuẩn.
Kết quả cho thấy, chủng T5 sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 320C.
3.3.7. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn T5
Để chọn pH thích hợp cho chủng vi khuẩn T5, thí nghiệm tiến hành khảo sát dãy pH: 5, 6, 7, 8. Kết quả được ghi nhận qua bảng 3.16.
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn T5 Thời gian
theo dõi (ngày)
Chỉ số OD610nm của vi khuẩn T5 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 0 0,083 0,084 0,083 0,083 2 0,117 0,144 0,183 0,180 4 0,165 0,246 0,401 0,374 6 0,228 0,333 0,766 0,717 8 0,134 0,293 0,665 0,675 10 0,076 0,197 0,486 0,447
Ở các nghiệm thức về pH đều cho kết quả chỉ số OD cao nhất tức nồng độ tế bào trong dung dịch nuơi cấy cao nhất đều vào ngày thứ 6 nuơi cấỵ Kết quả này một lần nữa khẳng định thời gian nuơi cấy để thu sinh khối là 6 ngày trên mơi trường Nfb.
Ngồi ra, kết quả cịn cho thấy vi khuẩn T5 sinh trưởng tốt ở mơi trường Nfb cĩ độ pH = 7 - 8. Chúng sinh trưởng kém ở mơi trường cĩ pH = 6 và rất kém ở pH = 5. Theo kết quả nghiên cứu của B. Joseph và cộng sự (2007),
Azotobacter và Rhizobium sinh trưởng mạnh ở pH: 6,8 – 7,7 [46].
Qua đĩ chứng tỏ pH càng thấp, mơi trường càng chua thì vi khuẩn T5 bị ức chế sinh trưởng càng mạnh. Khi pH mơi trường cĩ sự thay đổi, màng sinh chất
sẽ bị phá vỡ hoặc hoạt tính enzyme bị ức chế, … do đĩ ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn [8].
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 2 4 6 8 10
Thời gian theo dõi (ngày)
C h ỉ số đ o O D ( 61 0n m ) pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn sinh IAA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo khĩa phân loại Bergey, căn cứ đặc điểm hình thái, một số đặc điểm sinh học và khả năng sinh IAA đã khảo sát, vi khuẩn T5 được mơ tả như sau:
T5 là vi khuẩn Gram âm. Tế bào sau 1 ngày nuơi cấy dạng que, khi già cĩ dạng trịn. Đường kính tế bào 2,9 – 3,0µm. Khuẩn lạc trịn, bề mặt bĩng, nhẵn, mép bằng phẳng, cấu trúc đồng nhất, màu ngà. Khơng tạo màu khi nuơi cấy trong mơi trường lỏng. Catalase dương tính; pH tối thích: 7- 8, nhiệt độ tối thích: 320C. Phát triển được trên mơi trường cĩ nguồn cacbon là Manitol. Cĩ khả năng cố định nitơ phân tử, khả năng sinh IAẠ
Dựa vào những đặc điểm trên, vi khuẩn T5 thuộc lồi Azotobacter chroococcum, chi Azotobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales [35]. Theo tài liệu tham khảo, vào năm 1978, Harper, S.H.T và Lynch, J.M đã nghiên cứu ảnh hưởng của Azotobacter chroococcum đến sự nảy mầm và sinh trưởng thân mầm của lúa mạch [44]. Điều này phần nào phù hợp với nghiên cứu khác.
Dựa trên nghiên cứu của Cao Bình, trường Đại học Tây Nguyên về khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn được tuyển chọn trên các mơi trường nuơi cấy, trong đĩ cĩ vi khuẩn T5, kết quả thể hiện ở bảng 3.17.
Bảng 3.17. Khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn được tuyển chọn trên các mơi trường nuơi cấy
Nồng độ IAA (mg/l)
Mơi trường Nfb Mơi trường YEM Mơi trường YMA 34,794 ± 0,090j 5,789 ± 0,090b 8,276 ± 0,114f
Như vậy theo tác giả này, vi khuẩn chủng T5 được nuơi cấy trong mơi trường Nfb, lượng IAA được tạo ra rất cao so với nuơi cấy trong mơi trường YEM và YMẠ Vì vậy mơi trường Nfb đã được lựa chọn để nhân nuơi thu sinh khốị
Từ các kết quả nghiên cứu trên, để nhân nuơi sinh khối vi khuẩn T5,
Azotobacter chroococcum cần mơi trường lỏng Nfb, nhiệt độ thích hợp 320C, pH: 7 - 8, thời gian thu sinh khối: 6 - 8 ngày sau khi nuơi cấỵ
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Đề tài đã xác định được chủng T5 cĩ khả năng tăng tỉ lệ nảy mầm và sinh trưởng của cây mầm, tăng diện tích lá, số lượng nốt sần, rút ngắn thời gian ra hoa, tăng tỉ lệ đậu quả và năng suất cây đậu Cơvẹ Ngồi ra khi tưới dịch vi khuẩn T5, mật độ vi khuẩn trong đất tăng 1,14 đến 1,76 lần so với đất trước khi trồng đậụ
- Căn cứ vào khĩa phân loại vi khuẩn của Bergey, đề tài xác định được vi khuẩn sinh IAA T5 là vi khuẩn Azotobacter chroococcum. Khi sử dụng mơi trường Nfb, pH 7,0 và nuơi cấy vi khuẩn này ở 320C thời gian thu sinh khối là 6 - 8 ngày
2. Kiến nghị
- Định danh vi khuẩn T5 bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn sinh IAA chủng T5 đến một số đối tượng cây trồng khác, đặc biệt là các cây rau nhằm tìm biện pháp giảm tải việc sử dụng các chất kích thích sinh trưởng tổng hợp, đồng thời vẫn đáp ứng và nâng cao năng suất cây trồng.
- Phân lập và tuyển chọn từ các vùng đất khác ở Đắk Lắk cũng như ở Tây Nguyên các chủng vi khuẩn sinh IAA cao để nghiên cứu ứng dụng đáp ứng cho sự phát triển nơng nghiệp bền vững đồng thời bảo tồn đa dạng sinh học của địa phương.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Kim Anh và Phạm Thị Ngọc Anh (2008), Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Azotobacter cĩ hoạt tính nitrogenaza và sinh tổng hợp IAA (Indol axetic acid) từ đất thơn Bình Kỳ - Hịa Quý - Ngũ Hành Sơn - TP. Đà Nẵng, Tạp chí sinh học, trang 300 - 304.
2. Cao Bình (2010), “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh IAA trong đất tại xã CưM’Lan, huyện EaSoup, tỉnh Đắk Lắk”, Luận văn Thạc sĩ sinh học.
3. Tạ Thị Cúc (2003), Kỹ thuật trồng một số rau màu, NXB Nơng Nghiệp. 4. Phạm Việt Cường (2003), “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng thuộc chi Bacillus phân lập từ đất trồng tại Việt Nam”, Tạp chí sinh học, 213 - 217.
5. Lăng Ngọc Dậu (2004), “Khả năng cố định đạm, hịa tan lân và sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillum lipoferum”, Tạp chí sinh học, trang 445 - 448.
6. Nguyễn Ngọc Dũng (1992), “Khả năng sinh tổng hợp acid indole acetic của Azospirillum sp. phân lập từ vùng rễ cây lúa”, Tạp chí sinh học, 34 - 36.
7. Nguyễn Lân Dũng (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nộị
8. Nguyễn Lân Dũng (1979), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục Hà Nộị 9. Nguyễn Thành Đạt (2001), Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo Dục, trang 243 - 248.
10. Phạm Bích Hiền (2003), “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng
Azotobacter đa hoạt tính sinh học sử dụng cho sản xuất phân bĩn vi sinh vật chức năng”,Tạp chí sinh học, trang 266 - 270.
11. Nguyễn Như Khanh (1996), Sinh học phát triển thực vật. NXB Giáo Dục Hà Nộị (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12. Hồng Quốc Khánh (1999), “Sản xuất acid indole acetic bởi vi khuẩn căn tầng Azospirillum brasiliense”,Tạp chí sinh học, trang 412 - 415.
13. Phạm Thị Ngọc Lan và Trương Văn Lung (1999), “Bước đầu nghiên cứu vi khuẩn Azotobacter trong đất vùng gị đồi tỉnh Thừa Thiên - Huế”, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà Nội, trang 406 - 411.
14. Trần Kim, Hồng Đức Nhuận và Mai Sĩ Tuấn (2000), Sinh thái học về mơi trường, NXB Giáo Dục.
15. Nguyễn Đức Lượng (2003), Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM.
16. Vũ Thúy Nga (2003), “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA và phân giải phosphat vơ cơ khĩ tan của vi khuẩn Bradyrhizobium”, Tạp chí sinh