1.4.1. Nghiên cứu trong nước
Năm 2003, Phạm Việt Cường và cộng sự (Viện Cơng nghệ Sinh học) đã nghiên cứu về khả năng tạo IAA của một số chủng vi khuẩn chi Bacillus. Kết quả cho thấy khả năng tổng hợp IAA của các chủng nghiên cứu thay đổi tùy theo chủng giống, mơi trường nuơi cấy và một số nhân tố khác [4].
Vũ Thúy Nga và cộng sự tại Viện KHKT Nơng nghiệp Việt Nam (2003), nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và mơi trường nuơi cấy đến khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn Bradyrhizobium. Nhĩm tác giả kết luận: “ Khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn Bradyrhizobium khơng phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn mà phụ thuộc vào chủng giống vi khuẩn, mơi trường nuơi cấy, hàm lượng tryptophan. Mức độ phân giải phosphat vơ cơ của Bradyrhizobium phụ thuộc vào thời gian nuơi cấy”[16].
Năm 2003, Phạm Bích Hiên và Phạm Văn Toản (Viện KHKT Nơng nghiệp Việt Nam) đã nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng Azotobacter đa hoạt tính, cĩ khả năng sinh IAA sử dụng làm phân vi sinh chức năng. Hầu hết các chủng Azotobacter chroococcum thử nghiệm đều cĩ khả năng sinh trưởng, phát triển tốt ở nhiệt độ 25 - 300C, pH: 5,5 - 8,0 và trong mơi trường cĩ nguồn đường thay thế là rỉ đường [10].
Tại Trung tâm Giống Nơng nghiệp cây trồng, Thành phố Cần Thơ, Lăng Ngọc Dậu (2003) nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillum lipoferum. Trong điều kiện cĩ tryptophan, sau 2 ngày nuơi, một số chủng tổng hợp được nhiều IAA ( > 10ppm) [5].
Năm 2003, Phạm Văn Toản (Viện KHKT Nơng nghiệp Việt Nam), nghiên cứu hiệu quả sử dụng phân bĩn chứa hỗn hợp vi sinh vật cĩ khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng đối với cà chua, khoai tây, đậu phộng [22].
Năm 2008, Nguyễn Kim Anh và Phạm Thị Ngọc Anh (Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng), đã phân lập và tuyển chọn được 08 chủng vi khuẩn thuộc chi
Azotobacter cĩ khả năng cố định đạm và sinh tổng hợp IAA từ 30 mẫu đất của thơn Bình Kỳ- Hịa Quý - Ngũ Hành Sơn - thành phố Đà Nẵng [1].
Năm 2010, Cao Bình đã phân lập 23 chủng vi khuẩn cĩ khả năng sinh IAA từ đất trồng và rễ cây đậu phộng, đậu tương, đậu Cơve và ngơ. Sau khi đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng đã chọn được 11 chủng vi khuẩn. Thời gian nuơi cấy thích hợp để các chủng vi khuẩn sinh IAA mạnh nhất trong mơi trường Nfb với nồng độ tryptophan phù hợp là khác nhau giữa các chủng khác nhau [2].
1.4.2. Nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới cĩ rất nhiều nghiên cứu về các chủng vi khuẩn cĩ khả năng sinh IAA, từ vi khuẩn sống cộng sinh ở nốt sần của rễ cây đến vi khuẩn sống tự do trong đất như: Rhizobium, Azotobacter, Azospirrillum, Bradyrhizobium,… [41], [42], [46], [48], [49], [52], [55], [57], [62].
Năm 1986, Paola Barbieri và Tiziano Zanelli (Ytalia), nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn Azospirillum brasilense Sp6 lên lúa mì. Khi lúa mì được nhiễm chủng vi khuẩn Azospirillum brasilense Sp6, số lượng và chiều dài rễ bên tăng lên đáng kể: 15,67 rễ bên và 18,80 cm so với đối chứng khơng nhiễm vi khuẩn: 8,25 rễ bên và 5,78 cm [56].
Năm 1996, Elazar Fallik’ và Yaacove Okon (Iran), nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn sinh IAA Azospirillum brasilense lên sự tăng trưởng của ngơ. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhà kính, ngơ được xử lý với vi khuẩn
Azospirillum brusilense cho kết quả tăng chiều cao thân, trọng lượng khơ cây và tăng trọng lượng hạt [38].
Năm 2000, Maria Guineth Torres - Rubio (Colombia) cùng cộng sự đã phân lập được một số chủng Azotobacter và Pseudomonas cĩ khả năng sinh IAA từ vùng rễ cây lúạ Lượng IAA do vi khuẩn Azotobacter và Pseudomonas sinh ra biến động: 3,5 - 32,2 mg/l sau 3 ngày nuơi cấy [54].
Năm 2001, Vivek Kumar và cộng sự (Ấn Độ), nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn sinh IAA Azotobacter chroococcumlên sinh trưởng và phát triển cây lúa mì. Kết quả nghiên cứu cho thấy những nghiệm thức được xử lý với vi khuẩn sinh IAA Azotobacter chroococcumcĩ trọng lượng hạt (1000 hạt) tăng 11,4%; trọng lượng rơm tăng 11,3% so với đối chứng khơng dùng vi khuẩn [63].
Năm 2007, Gh. Abbas Akbari và cộng sự (Iran) đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng Azosopirrillum sp. cĩ khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng cây lúa mì. IAA được sinh ra bởi một số chủng vi khuẩn
Azosopirrillum sp. là động lực giúp cây sinh trưởng, hình thành rễ tốt [27].
Năm 2009, Fabricio Cassan và cộng sự (Argentina), nghiên cứu ảnh hưởng của 2 chủng vi khuẩn Azospirillum brasilense Az39 và Bradyrhizobium japonicum E109 đến sự nảy mầm, sinh trưởng thân mầm của đậu tương và bắp. Các nghiệm thức được xử lý độc lập hay kết hợp 2 chủng vi khuẩn trên đều cho chiều dài rễ và trọng lượng khơ thân cao hơn so với đối chứng khơng sử dụng vi khuẩn [40].
Năm 2009, Mandira Malhotra và Sheela Srivastava (Ấn Độ), nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn sinh IAA Azospirillum brasilense SM lên sự sinh trưởng, phát triển của lúa miến. Khi lúa miến được nhiễm vi khuẩn Azospirillum brasilense SM sau 2 tuần gieo trồng cho chiều dài rễ mầm: 7,8 cm, thân mầm: 19,2 cm, số lượng rễ con: 24,5 rễ con so với đối chứng khơng sử dụng vi khuẩn cĩ chiều dài rễ mầm: 6,12 cm, chiều dài thân mầm 19,0 cm, và 17 rễ con [53].
Năm 2011, B.S. Saharan và V. Nehra (Ấn Độ), nghiên cứu ảnh hưởng của các vi khuẩn vùng rễ đến sự sinh trưởng, phát triển của câỵ Kết quả nghiên cứu
cho thấy vi khuẩn Azospirillum cĩ khả năng cố định đạm, thúc đẩy cây sinh trưởng, tăng năng suất thu hoạch [59].
1.5. Điều kiện tự nhiên của Buơn Ma Thuột
Mang nét đặc trưng của khí hậu Tây Nguyên, Thành phố Buơn Ma Thuột cĩ hai mùa mưa và khơ rõ rệt. Trong đĩ, mùa mưa kéo dài từ tháng 5 đến hết tháng 10, cĩ đặc điểm mưa nhiều, lượng mưa lớn, tập trung, trung bình 69,9 mm/tháng, 1.830 - 2.200 mm/năm. Mùa khơ kéo dài từ tháng 11 đến tháng 4 năm saụ Vào mùa khơ do trải qua giai đoạn nắng nĩng 6 tháng liên tục với số giờ nắng qua các năm biến động từ 1.966 - 2.487,5 giờ. Điều này thuận lợi cho quá trình quang hợp và hạn chế sự phát triển của sâu bệnh trên các loại cây trồng như rau, nhưng mùa khơ thường gây hạn hán. Do đĩ thiếu nước tưới cho trồng trọt do lượng mưa quá ít, mạch nước ngầm giảm thấp và quá trình thốt hơi nước quá nhanh.
Nhiệt độ trung bình các tháng trong năm giao động từ 23,60C - 260C, tốc độ giĩ từ 1,3 - 4,7 m/s.
CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung
1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh IAA ảnh hưởng đến sinh trưởng cây mầm đậu Cơvẹ
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn sinh IAA được tuyển chọn lên sự nảy mầm của hạt và sinh trưởng, phát triển của cây đậu Cơvẹ
3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn được tuyển chọn để định danh và nhân nuơi sinh khốị
2.2. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Các chủng vi khuẩn cĩ khả năng sinh IAA cao T5, P5, V1 phân lập trong đất trồng và rễ cây đậu tương, đậu phộng, đậu Cơve của Easup, Đắk lắk.
- Hạt giống đậu Cơve được bán tại thị trường (giống TLP - 68).
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh học thực nghiệm - Khoa Khoa học Tự Nhiên và Cơng nghệ, trường Đại học Tây Nguyên.
- Vườn thực nghiệm của Khoa Nơng Lâm nghiệp, trường Đại học Tây Nguyên. - Thời gian nghiên cứu: tháng 09/ 2010 đến tháng 09/2011.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh IAA ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây mầm đậu Cơvẹ sinh trưởng của cây mầm đậu Cơvẹ
Thực hiện trên 3 chủng vi khuẩn sinh IAA : T5, P5, V1.
2.3.1.1. Tạo dung dịch thí nghiệm
- Mơi trường nhân nuơi Nfb (g/l): KH2PO4 0,5g, MgSO4.7H2O 5g, NaCl 0,2g, CaCl2.2H2O 0,02g, KOH 4,5g, Biotin 0,01g, acid malic 5g, Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N: 3ml, FeEDTA 1,64%: 10ml. Vi lượng: 2ml (MgS04.7H2O 0,2g/l, H3BO3 1,4g/l, ZnSO4 0,12g/l, CuSO4 0,04g/l, Na2MoO4.2H2O 1g/l), nước cất khơng đạm 1000ml, pH = 6,8.
- Chuẩn bị mơi trường lỏng trong các bình tam giác, 200ml/bình. Khử trùng ở áp suất 1atm, trong 30 phút. Để nguội, cấy chủng vi khuẩn vào các bình, lắc 200 vịng/phút, nhiệt độ phịng.
- Sau 5 ngày nuơi cấy, thu dung dịch, xác định nồng độ tế bào vi khuẩn (CFU/ml), nồng độ IAA (mg/lít).
2.3.1.2. Xác định nồng độ vi khuẩn trong dung dịch
Dùng phương pháp đo OD610nm và đếm khuẩn lạc trên đĩa petri để xây dựng phương trình đường chuẩn về mối tương quan giữa chỉ số OD610nm và nồng độ tế bào trong dung dịch nuơi cấy vi khuẩn. Dựa vào phương trình đường chuẩn, xác định nồng độ vi khuẩn qua chỉ số OD tương ứng.
2.3.1.3. Xác định phương trình tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ
IAA (mg/l)
- Chuẩn bị dung dịch đệm Phosphat(200ml)
A: KH2PO4 0,136 g/100ml nước cất B: K2HPO4 0,174 g/100 ml nước cất
39ml A+ 61 ml B và cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH =7.
- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski
553ml H2SO4 (98%) và nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8 M.
Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8 M đã pha ở trên để được thuốc thử Salkowskị
- Xây dựng phương trình đường chuẩn IAA
Phương trình xác định mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA (mg/l) trong dung dịch nuơi cấy vi khuẩn.
Cân 16 mg IAA tổng hợp hịa tan với 100ml dung dịch đệm Phosphat được nồng độ 160mg/l, sau đĩ tiến hành pha lỗng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 (mg/l).
4ml thuốc thử được cho vào các ống nghiệm cĩ nồng độ IAA khác nhau cĩ thể tích 2ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.
Ủ 10 phút ở nhiệt độ phịng để phản ứng xảy ra hồn tồn. Đo OD530nm. Từ kết các quả trên, xác định được phương trình đường chuẩn của dung dịch IAA thơng qua chỉ số OD530nm.
2.3.1.4. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn sinh IAA lên sự sinh trưởng cây mầm đậu Cơve
- Hạt đậu Cơve cĩ trọng lượng: 400hạt/100g. Chọn các hạt đồng đều, chắc. - Rửa hạt bằng nước sạch nhiều lần. Ngâm hạt trong dung dịch thí nghiệm 12 giờ. Gieo hạt trong các chậu nhựa chứa cát đã rửa sạch. Chậu nhựa cĩ đường kính 8cm, cao 10cm. Lượng cát cho vào mỗi chậu 300g.
-Bố trí thí nghiệm:hạt được ngâm trong các dung dịch sau:
+ Chủng T5: với các nồng độ tế bào 1011, 1010, 109, 108 CFU/ ml.
+ Chủng P5: với các nồng độ tế bào 1011, 1010, 109, 108 CFU/ ml.
+ Chủng V1: với các nồng độ tế bào 1011, 1010, 109, 108 CFU/ ml.
+ Dung dịch IAA ( 1,5 ppm ).
+ Nước.
- Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỉ lệ nảy mầm (%) = (Số hạt nảy mầm/ tổng số hạt gieo) x 100. + Chiều dài rễ, thân mầm (mm).
+ Số lượng rễ con.
+ Trọng lượng tươi, khơ của rễ, thân mầm sau 5 ngày gieo trồng (mg).
2.3.2. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn sinh IAA được tuyển chọn lên sự nảy mầm của hạt và sinh trưởng, phát triển của đậu Cơve
2.3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt và nồng độ vi khuẩn sinh IAA được tuyển chọn đến sự nảy mầm và sinh trưởng cây mầm đậu Cơvẹ
Chọn chủng tốt nhất trong 3 chủng vi khuẩn T5, P5, V1 qua kết quả thí nghiệm trên để tiến hành thí nghiệm.
- Mơi trường nuơi cấy vi khuẩn sinh IAA: Nfb.
- Các khoảng thời gian ngâm hạt trong dung dịch nuơi cấy vi khuẩn sinh IAA: 8, 12, 16, 20 giờ.
- Các nồng độ vi khuẩn trong dung dịch nuơi cấy: 1010, 109, 108, 107 CFU/ml.
- Các nghiệm thức đối chứng: dung dịch IAA 1,5 ppm, dung dịch Nfb, nước. Mỗi chậu thí nghiệm gieo 5 hạt. Mỗi nghiệm thức thực hiện 15 chậụ Phun nước 2 lần/ngàỵ Mỗi lần phun 2ml/chậụ Theo dõi và lấy số liệu từ 1 - 5 ngày sau gieo trồng.
- Các chỉ tiêu theo dõi
+ Tỉ lệ nảy mầm (%) = (Số hạt nảy mầm/ tổng số hạt gieo) x 100. + Chiều dài rễ, thân mầm (mm).
+ Số lượng rễ con.
+ Trọng lượng tươi, khơ của rễ, thân mầm sau 5 ngày gieo trồng (mg).
2.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ và số lần tưới của vi khuẩn sinh IAA được chọn đến sinh trưởng phát triển cây đậu Cơve
+ Chậu nhựa cĩ đường kính 25cm, sâu 30cm, cĩ đục lỗ nhỏ. + Lượng đất trong các chậu trồng đậu đồng nhất và 10 kg/chậụ
+ Số lần tưới dịch trong giai đoạn sinh trưởng của cây đậu: 1 lần, 2 lần, 3 lần. + Dung dịch của từng nghiệm thức được dùng để ngâm hạt 16 giờ trước khi gieo và tưới vào đất trồng đậụ Gieo 2 hạt/chậu, tưới 5 ml/chậu/lần.
- Chế độ tưới nước: Tùy vào điều kiện thời tiết, mỗi ngày tưới 1-2 lần, lượng nước vừa đủ độ ẩm cho đất 70 - 80%.
- Chế độ phân bĩn: phân tổng hợp N-P-K cĩ hàm lượng 16-16-8 vào thời kỳ 15, 30, 45 ngày sau gieo trồng. Sử dụng: 40g NPK/lít nước, phun 5ml/chậụ
Bảng 2.1. Ký hiệu các nghiệm thức theo nồng độ và số lần tưới dịch thí nghiệm. Dung dịch và nồng độ xử lý Số lần tưới dịch Ký hiệu nghiệm thức Vi khuẩn T5 (CFU/ml) 1010 1 C1T1 2 C1T2 3 C1T3 109 1 C2T1 2 C2T2 3 C2T3 108 1 C3T1 2 C3T2 3 C3T3 IAA (1,5 ppm) 1 C4T1 2 C4T2 3 C4T3 Nfb 1 C5T1 2 C5T2 3 C5T3 Nước 1 C6T1 2 C6T2 3 C6T3
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tổng số lá hình thành. + Diện tích lá (cm2/lá).
+Thời gian ra hoa: khi cĩ 50% số cây nở hoạ
+ Số hoa trên chùm: xác định trên 9 chùm. Tính 2 đợt.
+ Tỉ lệ đậu quả (%) = ( Số quả đếm được/Số hoa đếm được) * 100.
+ Năng suất quả tươi thu hoạch: ở các lần thu hoạch (g)
+ Trọng lượng khơ của cây (mg): mẫu được sấy ở nhiệt độ 700C cho đến khi trọng lượng mẫu khơng đổị
+ Số nốt sần/cây
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá vi sinh vật đất sau nuơi trồng đậu Cơve
* Mơi trường nuơi cấy
- Mơi trường định lượng vi khuẩn (nước thịt pepton): pepton 10g, nước mắm 20ml, agar 20g, nước 1.000ml.
- Mơi trường định lượng xạ khuẩn (Gause): tinh bột tan 20g, K2HPO4 3g, MgSO4 3g, KNO3 1g, FeSO4 0,01g, NaCl 0,5g, agar 20g, nước 1000ml, pH = 7,2.
- Mơi trường định lượng nấm mốc (PGA): khoai tây 200g, glucose 20g, agar 20g, nước 1000ml, pH = 6,5.
* Thu mẫu đất
Đất cách bề mặt 5 - 10cm được lấy bằng dụng cụ và túi polyetylen (PE) vơ trùng. Mỗi nghiệm thức gồm 10 chậu trồng đậu, lượng đất thu 100g/nghiệm thức. Đồng nhất mẫu, phân tích vi sinh vật tổng số.
Thời điểm thu mẫu đất: trước khi gieo hạt và sau khi thu hoạch.
* Pha lỗng mẫu theo hệ số thập phân.
Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác cĩ chứa 90 ml dung dịch nước muối 0,1% vơ trùng, lắc đều hỗn hợp trong 10 phút. Dùng micropipet cĩ đầu típ vơ trùng hút 1ml dung dịch mẫu trên vào một ống nghiệm cĩ chứa 9 ml dung dịch nước muối 0,1% vơ trùng ta được độ pha lỗng 10-1. Tiếp tục tiến hành tượng tự ta được các độ pha lỗng từ 10-1 đến 10-5. Mọi thao tác đều phải thực hiện trong điều kiện vơ trùng.
* Cấy trãi trên đĩa
Chọn 3 độ pha lỗng liên tiếp: 10-3, 10-4, 10-5. Hút 0,05 ml dung dịch được pha lỗng ở mỗi nồng độ vào các đĩa petri chứa mơi trường nuơi cấỵ Dùng que gạt thủy tinh vơ trùng dàn đều dung dịch lên mặt thạch của đĩa petri, và ủ 3-5 ngày ở nhiệt độ phịng. Thực hiện 3 đĩa petri cho một độ pha lỗng.
* Xác định số lượng vi sinh vật tổng số
Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa petri, đếm tất cả số
