Xác định phương trình tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA

IAA (mg/l)

- Chuẩn bị dung dịch đệm Phosphat(200ml)

A: KH₂PO₄ 0,136 g/100ml nước cất B: K₂HPO₄ 0,174 g/100 ml nước cất

39ml A+ 61 ml B và cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH =7.

- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski

553ml H₂SO₄ (98%) và nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H₂SO₄ đậm đặc 10,8 M.

Cân 4,5g FeCl₃ cho vào 1 lít H₂SO₄ 10,8 M đã pha ở trên để được thuốc thử Salkowskị

- Xây dựng phương trình đường chuẩn IAA

Phương trình xác định mối tương quan giữa chỉ số OD_530nm và nồng độ IAA (mg/l) trong dung dịch nuơi cấy vi khuẩn.

Cân 16 mg IAA tổng hợp hịa tan với 100ml dung dịch đệm Phosphat được nồng độ 160mg/l, sau đĩ tiến hành pha lỗng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 (mg/l).

4ml thuốc thử được cho vào các ống nghiệm cĩ nồng độ IAA khác nhau cĩ thể tích 2ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.

Ủ 10 phút ở nhiệt độ phịng để phản ứng xảy ra hồn tồn. Đo OD_530nm. Từ kết các quả trên, xác định được phương trình đường chuẩn của dung dịch IAA thơng qua chỉ số OD_530nm.

2.3.1.4. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn sinh IAA lên sự sinh trưởng cây mầm đậu Cơve

- Hạt đậu Cơve cĩ trọng lượng: 400hạt/100g. Chọn các hạt đồng đều, chắc. - Rửa hạt bằng nước sạch nhiều lần. Ngâm hạt trong dung dịch thí nghiệm 12 giờ. Gieo hạt trong các chậu nhựa chứa cát đã rửa sạch. Chậu nhựa cĩ đường kính 8cm, cao 10cm. Lượng cát cho vào mỗi chậu 300g.

-Bố trí thí nghiệm:hạt được ngâm trong các dung dịch sau: + Chủng T5: với các nồng độ tế bào 10¹¹, 10¹⁰, 10⁹, 10⁸ CFU/ ml. + Chủng P5: với các nồng độ tế bào 10¹¹, 10¹⁰, 10⁹, 10⁸ CFU/ ml. + Chủng V1: với các nồng độ tế bào 10¹¹, 10¹⁰, 10⁹, 10⁸ CFU/ ml. + Dung dịch IAA ( 1,5 ppm ).

+ Nước.

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỉ lệ nảy mầm (%) = (Số hạt nảy mầm/ tổng số hạt gieo) x 100. + Chiều dài rễ, thân mầm (mm).

+ Số lượng rễ con.

+ Trọng lượng tươi, khơ của rễ, thân mầm sau 5 ngày gieo trồng (mg).

2.3.2. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn sinh IAA được tuyển chọn lên sự nảy mầm của hạt và sinh trưởng, phát triển của đậu Cơve

2.3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt và nồng độ vi khuẩn sinh IAA được tuyển chọn đến sự nảy mầm và sinh trưởng cây mầm đậu Cơvẹ

Chọn chủng tốt nhất trong 3 chủng vi khuẩn T5, P5, V1 qua kết quả thí nghiệm trên để tiến hành thí nghiệm.

- Mơi trường nuơi cấy vi khuẩn sinh IAA: Nfb.

- Các khoảng thời gian ngâm hạt trong dung dịch nuơi cấy vi khuẩn sinh IAA: 8, 12, 16, 20 giờ.

- Các nồng độ vi khuẩn trong dung dịch nuơi cấy: 10¹⁰, 10⁹, 10⁸, 10⁷ CFU/ml.

- Các nghiệm thức đối chứng: dung dịch IAA 1,5 ppm, dung dịch Nfb, nước. Mỗi chậu thí nghiệm gieo 5 hạt. Mỗi nghiệm thức thực hiện 15 chậụ Phun nước 2 lần/ngàỵ Mỗi lần phun 2ml/chậụ Theo dõi và lấy số liệu từ 1 - 5 ngày sau gieo trồng.

- Các chỉ tiêu theo dõi

+ Tỉ lệ nảy mầm (%) = (Số hạt nảy mầm/ tổng số hạt gieo) x 100. + Chiều dài rễ, thân mầm (mm).

+ Số lượng rễ con.

+ Trọng lượng tươi, khơ của rễ, thân mầm sau 5 ngày gieo trồng (mg).

2.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ và số lần tưới của vi khuẩn sinh IAA được chọn đến sinh trưởng phát triển cây đậu Cơve

+ Chậu nhựa cĩ đường kính 25cm, sâu 30cm, cĩ đục lỗ nhỏ. + Lượng đất trong các chậu trồng đậu đồng nhất và 10 kg/chậụ

+ Số lần tưới dịch trong giai đoạn sinh trưởng của cây đậu: 1 lần, 2 lần, 3 lần. + Dung dịch của từng nghiệm thức được dùng để ngâm hạt 16 giờ trước khi gieo và tưới vào đất trồng đậụ Gieo 2 hạt/chậu, tưới 5 ml/chậu/lần.

- Chế độ tưới nước: Tùy vào điều kiện thời tiết, mỗi ngày tưới 1-2 lần, lượng nước vừa đủ độ ẩm cho đất 70 - 80%.

- Chế độ phân bĩn: phân tổng hợp N-P-K cĩ hàm lượng 16-16-8 vào thời kỳ 15, 30, 45 ngày sau gieo trồng. Sử dụng: 40g NPK/lít nước, phun 5ml/chậụ

Bảng 2.1. Ký hiệu các nghiệm thức theo nồng độ và số lần tưới dịch thí nghiệm. Dung dịch và nồng độ xử lý Số lần tưới dịch Ký hiệu nghiệm thức Vi khuẩn T5 (CFU/ml) 10¹⁰ 1 C1T1 2 C1T2 3 C1T3 10⁹ 1 C2T1 2 C2T2 3 C2T3 10⁸ 1 C3T1 2 C3T2 3 C3T3 IAA (1,5 ppm) 1 C4T1 2 C4T2 3 C4T3 Nfb 1 C5T1 2 C5T2 3 C5T3 Nước 1 C6T1 2 C6T2 3 C6T3

- Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tổng số lá hình thành. + Diện tích lá (cm²/lá).

+Thời gian ra hoa: khi cĩ 50% số cây nở hoạ

+ Số hoa trên chùm: xác định trên 9 chùm. Tính 2 đợt.

+ Tỉ lệ đậu quả (%) = ( Số quả đếm được/Số hoa đếm được) * 100.

+ Năng suất quả tươi thu hoạch: ở các lần thu hoạch (g)

+ Trọng lượng khơ của cây (mg): mẫu được sấy ở nhiệt độ 70⁰C cho đến khi trọng lượng mẫu khơng đổị

+ Số nốt sần/cây

2.3.2.3. Phương pháp đánh giá vi sinh vật đất sau nuơi trồng đậu Cơve

* Mơi trường nuơi cấy

- Mơi trường định lượng vi khuẩn (nước thịt pepton): pepton 10g, nước mắm 20ml, agar 20g, nước 1.000ml.

- Mơi trường định lượng xạ khuẩn (Gause): tinh bột tan 20g, K₂HPO₄ 3g, MgSO₄ 3g, KNO₃ 1g, FeSO₄ 0,01g, NaCl 0,5g, agar 20g, nước 1000ml, pH = 7,2.

- Mơi trường định lượng nấm mốc (PGA): khoai tây 200g, glucose 20g, agar 20g, nước 1000ml, pH = 6,5.

* Thu mẫu đất

Đất cách bề mặt 5 - 10cm được lấy bằng dụng cụ và túi polyetylen (PE) vơ trùng. Mỗi nghiệm thức gồm 10 chậu trồng đậu, lượng đất thu 100g/nghiệm thức. Đồng nhất mẫu, phân tích vi sinh vật tổng số.

Thời điểm thu mẫu đất: trước khi gieo hạt và sau khi thu hoạch.

* Pha lỗng mẫu theo hệ số thập phân.

Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác cĩ chứa 90 ml dung dịch nước muối 0,1% vơ trùng, lắc đều hỗn hợp trong 10 phút. Dùng micropipet cĩ đầu típ vơ trùng hút 1ml dung dịch mẫu trên vào một ống nghiệm cĩ chứa 9 ml dung dịch nước muối 0,1% vơ trùng ta được độ pha lỗng 10^-1. Tiếp tục tiến hành tượng tự ta được các độ pha lỗng từ 10^-1 đến 10^-5. Mọi thao tác đều phải thực hiện trong điều kiện vơ trùng.

* Cấy trãi trên đĩa

Chọn 3 độ pha lỗng liên tiếp: 10^-3, 10^-4, 10^-5. Hút 0,05 ml dung dịch được pha lỗng ở mỗi nồng độ vào các đĩa petri chứa mơi trường nuơi cấỵ Dùng que gạt thủy tinh vơ trùng dàn đều dung dịch lên mặt thạch của đĩa petri, và ủ 3-5 ngày ở nhiệt độ phịng. Thực hiện 3 đĩa petri cho một độ pha lỗng.

* Xác định số lượng vi sinh vật tổng số

Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa petri, đếm tất cả số khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa cĩ số khuẩn lạc từ 20 đến 200 để tính kết quả.

Số lượng vi sinh vật trong 1g mẫu được tính như sau: A (CFU/g) = N/(n₁vf₁ + n₂vf₂ +...+ n_ivf_i)

Trong đĩ: A: Số tế bào hình thành khuẩn lạc vi sinh vật trong 1g mẫụ N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa được chọn.

n_i: Số lượng đĩa cĩ số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha lỗng. v: Dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩạ

f_i: Độ pha lỗng của đĩa được đếm [15], [21].

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn được tuyển chọn để định danh và nhân nuơi sinh khối

2.3.3.1. Mơ tả hình thái, màu sắc và đặc điểm khuẩn lạc

Tiến hành quan sát khuẩn lạc đơn dưới kính hiển vi soi nổị Thực hiện tiêu bản ướt quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 40, 100.

Các chỉ tiêu mơ tả hình thái vi khuẩn:

- Khuẩn lạc: dạng, cấu trúc, bề mặt, độ nổi, bìa và màu sắc. - Hình dạng và kích thước của tế bàọ

2.3.3.2. Phương pháp nhuộm Gram

1. Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm. 2. Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn. 3. Dùng tím Violet nhuộm mẫu trong 1 phút. 4. Rửa nước tối đa 5 giâỵ

5. Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút. 6. Rửa bằng rượu trong 10 giâỵ

7. Phủ lên mẫu với ethanol 95% vài lần cho đến khi khơng xuất hiện thêm màu trong mẫu (1 phút).

9. Nhuộm tiếp với Fuchsin. 10. Rửa qua nước, để khơ.

2.3.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính catalase

Đây là một đặc điểm của một số vi sinh vật hiếu khí. Vi sinh vật kỵ khí bắt buộc và nhiều loại vi khuẩn hiếu khí khơng sinh catalasẹ Catalase phân hủy H₂O₂ và tạo thành oxy theo phản ứng sau:

H₂O₂ H₂O + O₂

Cho 1 giọt dung dịch H₂O₂ 30% lên trên khuẩn lạc vi khuẩn hoặc trên bề mặt vi khuẩn trong ống nghiệm. Vi khuẩn sủi bọt khí khẳng định là catalase dương tính, vi khuẩn khơng sủi bọt là catalase âm tính.

2.3.3.4. Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ phân tử

Chuẩn bị mơi trường Ashby với agar khơng dinh dưỡng đã được loại bỏ hồn tồn nguồn nitơ. Khử trùng ở 1atm, 45 phút. Phân bố mơi trường đã khử trùng vào 12 đĩa petri vơ trùng.

Cấy vi khuẩn khảo sát vào các đĩa peptri mơi trường. Bọc kín các đĩa petri bằng polyethylen. Ủ 5 - 7 ngày, quan sát, phát hiện các khuẩn lạc mọc trên mơi trường Ashbỵ Đối chiếu đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các khuẩn lạc xuất hiện với chủng khảo sát được cấy vàọ

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đánh giá chính xác khả năng cố định nitơ tự do của chủng vi khuẩn. Đồng thời căn cứ vào mức độ phát triển để kết luận vi khuẩn thuộc nhĩm vi đạm hay cố định đạm. Vi sinh vật vi đạm là nhĩm vi sinh vật cĩ thể sử dụng được một lượng nhỏ nitrogen liên kết chứa trong các hĩa chất, nước máy, trong khơng khí.

2.3.3.5. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng

Nuơi cấy vi khuẩn tuyển chọn vào mơi trường Nfb khơng agar của 39 ống nghiệm đồng thời chuẩn bị 13 ống mơi trường khơng cấy vi khuẩn để làm ống khơng

cho kỹ thuật đo OD. Tiến hành đo OD_610nm dịch nuơi vi khuẩn mỗi ngàỵ Mỗi ngày đo OD của 3 ống nuơi cấy vi khuẩn. Đo liên tiếp 12 ngày và ghi lại kết quả.

2.3.3.6. Phương pháp xác định nhiệt độ thích hợp của chủng vi khuẩn sinh IAA

Chuẩn bị dung dịch giống: cấy chủng vi khuẩn khảo sát trong ống giống vào bình chứa 100 ml mơi trường Nfb khơng agar. Lắc dung dịch vi khuẩn trên máy trong 24 giờ.

Mỗi ống nghiệm chứa 9ml mơi trường Nfb và 1ml giống. Nồng độ tế bào vi khuẩn trong 1ml giống cho vào từng ống nghiệm của các lơ thí nghiệm khảo sát là như nhaụ

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của vi khuẩn với biến động từ 25, 32, 39, 46⁰C.

Thí nghiệm gồm 4 lơ theo 4 nhiệt độ khảo sát. Số ống nghiệm mơi trường Nfb cho mỗi lơ: 24. Đo OD_610nm vào thời điểm sau khi cấy và sau 2, 4, 6, 8, 10 ngàỵ Mỗi thời điểm lặp lại 3 lần.

2.3.3.7. Phương pháp xác định pH thích hợp của chủng vi khuẩn sinh IAA

Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp nhưng khảo sát ở 4 mức pH: 5, 6, 7, 8.

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh IAA ảnh hưởng đến sự sinh trưởng cây mầm đậu Cơvẹ trưởng cây mầm đậu Cơvẹ

Thí nghiệm tiến hành nuơi cấy các chủng vi khuẩn T5, P5, V1 trong mơi trường Nfb. Sau 5 ngày, xác định nồng độ IAA (ppm) được tạo ra trong dung dịch vi khuẩn cĩ nồng độ tế bào 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ CFU/ml.

Bảng 3.1. Tương quan giữa nồng độ vi khuẩn và IAA trong dung dịch nuơi cấy Chủng vi khuẩn Nồng độVK (CFU/ml) Nồng độ IAA (ppm)

T5 10¹¹ 28,74 10¹⁰ 2,87 10⁹ 0,29 10⁸ 0,03 P5 10¹¹ 27,23 10¹⁰ 2,72 10⁹ 0,26 10⁸ 0,03 V1 10¹¹ 21,04 10¹⁰ 2,10 10⁹ 0,21 10⁸ 0,02

3.1.1. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến tỷ lệ nảy mầm của hạt

Ảnh hưởng của các dung dịch xử lý đến sự nảy mầm của hạt đậu được ghi nhận qua bảng 3.2.

Sau 1 ngày gieo trồng, tỉ lệ nảy mầm của hạt cĩ sự chênh lệch giữa các nghiệm thức. Tỉ lệ nảy mầm của hạt ngâm trong dung dịch chứa vi khuẩn sinh IAA và dung dịch IAA 1,5 ppm tương đương hoặc cao hơn so với tỉ lệ nảy mầm

của hạt ngâm trong nước. Dung dịch ngâm hạt là IAA 1,5 ppm cho tỉ lệ nảy mầm tương đương với dung dịch nuơi cấy vi khuẩn sinh IAA của 3 chủng cĩ nồng độ IAA biến động từ 0,21 - 2,87ppm (nồng độ tế bào vi khuẩn: 10⁹ - 10¹⁰ CFU/ml).

Ngồi ra, sau 2 ngày, chủng T5 cho tỉ lệ nảy mầm của hạt đạt 100% ở các nồng độ vi khuẩn từ 10⁸ - 10¹⁰ CFU/ml; chủng P5 cho tỉ lệ 100% ở nồng độ 10⁹ CFU/ml, chủng V1 cho tỉ lệ 100% ở các nồng độ 10⁹, 10¹⁰ CFU/ml. Riêng ở nồng 10¹¹ CFU/ml đối với cả 3 chủng vi khuẩn, tỉ lệ nảy mầm đều đạt 96,7% tương đương với tỉ lệ nảy mầm của nước. Như vậy, ở nồng độ này của các dung dịch vi khuẩn, lượng IAA sinh ra cao (21,04 - 28,74 ppm) nên ảnh hưởng khơng tốt đến sự nảy mầm của hạt.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến tỉ lệ nảy mầm của hạt Cơve Các dung dịch ngâm hạt Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml) Tỉ lệ nảy mầm (%) 1 ngày 2 ngày Vi khuẩn T5 10¹¹ 73,3 96.7 10¹⁰ 76,7 100 10⁹ 76,7 100 10⁸ 76,7 100 Vi khuẩn P5 10¹¹ 73,3 96,7 10¹⁰ 73,3 96,7 10⁹ 70,0 100 10⁸ 70,0 96,7 Vi khuẩn V1 10¹¹ 73,3 96,7 10¹⁰ 73,3 100 10⁹ 76,7 100 10⁸ 73,3 93,3 Nước 0 70,0 96,7 IAĂ1,5ppm) 0 73,3 100

Nhìn chung tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu được ngâm trong dịch chứa vi khuẩn T5 cĩ hiệu quả hơn so với chủng P5, V1.

Hình 3.1. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn sinh IAA đến tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu Cơve.

3.1.2. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến sinh trưởng của cây mầm

- Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩnđến chiều dài rễ mầm

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến chiều dài rễ, số rễ con và chiều dài thân mầm của cây đậu Cơve

Các dung dịch ngâm hạt Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml)

Các chỉ tiêu theo dõi sau 5 ngày gieo trồng Chiều dài rễ mầm (mm) Số lượng rễ con Chiều dài thân mầm (mm) Vi khuẩn T5 10¹¹ 183,89_±3,04^abc 12,44_±1,29^b 81,56_±1,11^ab 10¹⁰ 193,56_±4,15^c 14,11_±0,65^ab 84,44_±1,78^b 10⁹ 192,22_±3,29^c 12,00_±0,99^ab 84,67_±2,12^b 10⁸ 178,44_±4,03^ab 10,78_±0,62^a 79,33_±1,3^a Vi khuẩn P5 10¹¹ 179,44_±3,50^b 11,56_±0,96^a 78,22_±1,78^ab 10¹⁰ 190,00_±2,81^c 12,44_±1,18^a 81,22_±1,97^b 10⁹ 188,67_±2,28^c 11,56 _±0,84^a 80,67_±1,89^b 10⁸ 171,11_±2,31^a 11,56_±1,03^a 74,44_±2,43^a Vi khuẩn V1 10¹¹ 173,00_±3,34^a 12,78_±1,05^a 78,78_±1,66^ab 10¹⁰ 186,44_±4,10^b 11,33_±0,85^a 81,33_±1,62^b 10⁹ 186,44_±2,59^b 11,44_±0,37^a 81,11_±0,96^b 10⁸ 168,33_±3,33^a 11,22_±0,97^a 75,89_±1,18^a Nước 0 176,11_±3,07^a 10,44_±0,69^a 77,67_±2,0^a IAĂ1,5ppm) 0 187,33_±2,02^bc 12,11_±0,99^ab 81,11_±1,20^ab

Ghi chú: Các trị trung bình theo sau cĩ các mẫu tự giống nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa ở 5% theo phép thử Ducan.

Thí nghiệm cho thấy vào ngày thứ 5, ở cùng nồng độ 10¹⁰ CFU/ml, chiều dài rễ mầm của nghiệm thức sử dụng vi khuẩn T5 đạt 193,56 mm, P5: 190,00 mm, V1: 186,44 mm, so với nghiệm thức sử dụng dung dịch IAA 1,5 ppm: 187,33 mm và nước: 176,11 mm. Sự sai khác này cĩ ý nghĩa thống kê.