2. Bệnh khơ vằn trên lúa
2.2.6. Phương pháp định lượng Nitơ tổng số
2.2.6.1. Nguyên tắc Dưới tác dụng của H 2SO 4 đặc và các chất xúc tác, tất cả các dạng đạm hữu cơ được chuyển thành NH 4 + . Đẩy NH 4 + bằng dung dịch kiềm và hứng NH 3 thốt ra bằng dung dịch axit. 2.2.6.2. Dụng cụ và hĩa chất Hĩa chất
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 52 H 3BO 4 4%. HCl 0,25. H 2SO 4 đậm đặc. NaOH 32%. Methyl đỏ. Bromocresol xanh lá. Cồn 96o. Nước cất. Dụng cụ Bộ phá mẫu Kjeldahl. Bếp đun. Cối chày sứ. Bình định mức, bình tam giác, ống hút. Máy cất đạm Parnas Wargner.
2.2.6.3. Tiến hành
Quá trình định lượng Nitơ tổng sốđược tiến hành theo trình tự 3 bước sau
Bước 1: Xác định và phá mẫu
Cân 0,2 gam mẫu đã sấy khơ, nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 gam chất xúc tác và 5ml dung dịch H
2SO
4 đậm đặc, nối vào bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 53
Khi thời gian phá mẫu kết thúc, đễ ống phá mẫu nguội (khoảng 5 phút), bổ sung 10ml nước cất, trộn đều, để nguội và lắc vào máy chưng cất.
Bước 2: Chưng cất mẫu
Lắp ống phá mẫu vào bộ chưng cất, bổ sung thêm 30ml dung dịch NaOH 32%. Khởi động qui trình chưng cất, dịch chưng cất được thu nhờ bình thu cĩ bổ sung trước axit boric 4% và hỗn hợp chất chỉ thị. Ngừng cất khi thu được khoảng 125 – 150ml dịch chưng cất.
Bước 3: Chuẩn độ
Chuẩn độ bằng HCl 0,25N. Dừng chuẩn độ khi phát hiện màu phớt đỏ.
2.2.6.4. Tính tốn
Thơng qua số HCl 0,25N; người ta biết được lượng axit boric kết hợp với NH
3
và do vậy biết được số lượng NH
3 giải phĩng từ mẫu: trung bình cứ 1ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035g Nitơ hữu cơ. Kết quả tính tốn thể hiện theo Nitơ hữu cơ hoặc Nitơ tổng số.
Phần trăm Nitơ tổng (%): thơng thường protein chứa khoảng 16% N. Khí NH
3
nhận được khi chưng cất nhân với hệ số qui đổi là 100/16 ≅ 6,25 sẽ cho biết giá trị protein tương đương ( hay NH
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 54 2.2.7. Phương pháp định lượng phospho tổng số bằng quang phổ kế
Xác định hàm lượng phospho trong giới hạn nồng độ từ 1 – 20mg/cm3.
2.2.7.1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa vào khả năng của ion orthophosphate phản ứng với amonium molybdate tạo thành phosphomolybdate, phức chất cĩ màu xanh lơ.
2MoO 2.4MoO 3 + H 3PO 4 ⎯⎯⎯→ (MoO 2.4MoO 3)2H 3PO 4.4H 2O
Hàm lượng phospho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu đo ở bước sĩng hấp thu cực đại 650nm với cuvet cĩ chiều dài 10mm. Dung dịch đối chứng là dung dịch khơng.
2.2.7.2. Dụng cụ và hĩa chất Dụng cụ
Do phương pháp cĩ độ nhạy cao nên các dụng cụ thủy tinh địi hỏi phải thật sạch.
Bình định mức 50ml, 100ml.
Ống nghiệm cĩ l = 150mm và φ = 15mm.
Máy quang phổ kế và cuvet 10mm.
Hĩa chất
Tất cả các hĩa chất sử dụng trong thử nghiệm này phải đạt độ tinh khiết phân tích.
Nước sử dụng phải là nước cất hai lần. HCl đậm đặc.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 55 HNO 3 đậm đặc. Amoni molybdate. Hydroquinone [C 6H 4(OH) 2], pha khi sử dụng. Kali dihydrophosphate (KH 2PO 4).
Sodium sunphic (Na
2SO
3).
2.2.7.3. Tiến hành
Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 4325-86. Nếu mẫu khơ khơng khí, xử lý sơ bộ và bảo quản.
Nếu mẫu tươi, xử lý sơ bộ, cơ cạn , sấy ở 60oC, sấy ở 105oC, nghiền lấy mẫu trung bình.
Chuẩn bị dung dịch thuốc thử
Dung dịch 1: dung dịch chuẩn gốc (chứa 100μg phospho/ml). Hịa tan 1,4394 gam KH
2PO
4 trong bình định mức 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000 ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (chứa 25μg phospho/ml). Lấy 25ml dung dịch cho vào bình định mức 100ml và định mức bằng nước cất đúng 100ml, ta cĩ dung dịch 1A. Dung dịch HCl 10%: 250ml HCl đậm đặc cộng với 750ml nước cất. Dung dịch 2: Dung dịch Na 2SO 3 20%: cân 20 gam Na 2SO
3 hịa vào trong 100ml nước cất. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 56 Dung dịch 3: dung dịch hydroquinone 0,5%. Hịa tan 0,5 gam hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H
2SO
3, thêm tiếp nước cho đủ 100ml. Dung dịch chuẩn bi khi sử dụng.
Dung dịch 4: Thuốc thử Briggs hay dung dịch amoni molybdate 5%. Hịa tan 50 gam amoni molybdate trong 100ml nước cất. Cho 150ml H
2SO
4 đậm đặc vào trong 400ml nước. Để nguội thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% đã chuẩn bị vào hỗn hợp, để nguội thêm nước cho đủ 1000ml.
Hỗn hợp thuốc thử: trộn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1:1:1.
Chuẩn bị dung dịch tro phân tích
Cân chính xác 1 – 5 gam mẫu (tùy theo mẫu cĩ phospho nhiều hay ít).
Vơ cơ mẫu ở 550oC trong 4 giờ. Để nguội. Thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất
và thêm 10ml dung dịch HCl 10% và 0,5ml HNO
3 đậm đặc.
Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phịng. Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 250ml bằng nước cất.
Phản ứng lên màu
4. Lấy 10ml dung dịch tro cho vào bình hình nĩn dung tích 100ml, định mức cho đủ 100ml ta cĩ dung dịch thứ 2.
5. Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào trong ống nghiệm.
6. Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử + nước cất cho đủ 10ml. Trộn đều hỗn hợp, để 30 phút. Đo ở bước sĩng 650nm.
Tiến hành dựng đồ thịđường chuẩn
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 57
X (mgP) = (Abs * 0.0057)/ 0.0109
Abs : là giá trị mật độ quang của dịch thửđo ở bước sĩng 650nm
2.2. 7. 4 Tính tốn kết quả
Trong đĩ:
X: sốμg P cĩ trong dịch thử. V
ddtro: thể tích dung dịch sau khi tro hĩa. m: khối lượng mẫu thử (g).
106 : hệ số chuyển đổi từ g sang μg. V : thể tích thử.
Sai số giữa hai lần phân tích song song với độ tin cậy p = 0.95 khơng vượt quá d =28 ( 0.05 + 0.031X)%.
2.2.8. Phương pháp định lượng kali tổng số 2.2.8.1. Nguyên tắc
Dung dịch acid percloric (HClO
4) làm trầm hiện Kalium dưới dạng perclorat. Kết tinh lại để loại chất bẩn. Sấy khơ và cân trọng lượng KClO
4, từ đĩ suy ra hàm lượng Kalium.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 58 2.2.8.2. Dụng cụ và hố chất Dụng cụ Chén sứ nung. Bếp đun cách thủy. Bình định mức 250ml. Phễu lọc Bucher. Ống hút 1ml, 3ml, 5ml. Tủ say, bếp cách cát. Cân phân tích đến 0.0001g. Hĩa chất HCl đậm đặc. HClO 4 tinh khiết. Heliantin. Dung dịch BaCl
2 25%: Cho 250 gam BaCl
2 vào bình định mức 1000ml sau đĩ cho nước vào đến vạch định mức để hồ tan.
Dung dịch cồn 96o chứa 10ml HClO
4 trong 1000ml cồn. Cồn 96
o
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 59 2.2.8.3. Tiến hành:
• Cơng phá mẫu
Cân 0.2g mẫu đã sấy khơ hồn tồn, cho vào bình Kjeldahl, thêm 3-4ml dung dịch H
2SO
4 đậm đặc sao cho vừa ngập mẫu. Ngâm mẫu trong acid qua vài giờ (khoảng 4 giờ). Trong quá trình vơ cơ hĩa, các nguyên tố khống biến đổi dần thành các dạng oxid. Sau đĩ thêm vào bình vài giọt H
2O
2. đặt bình trên bếp điện, đun nĩng từ từ, tránh bếp nĩng đỏ làm nguyên liệu bắn lên thành bình và bị bắn ra ngồi(cĩ thể đặt bình trên lưới amiant). Khoảng 30 phút sau, tắt bếp, để nguội và cho thêm vài giọt H
2O
2, rồi đun tiếp. Lần này dung dịch chuyển sang màu cánh gián, đun trong 30 phút, để nguội, cho thêm khoảng 5 giọt H
2O
2 nữa rồi tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trắng hẳn.
• Định lượng Kalium
Cho vài giọt HCl đậm đặc vào chất cặn cịn lại từ dịch vơ cơ hố. Cho bốc hơi trên nồi chưng cách thủy. Lập lại thao tác như trên lần thứ 2. đun sơi chất cặn cịn lại ở 110 – 120oC trong 30 phút để làm silice hồn tồn khơng hồ tan, cho 1 giọt HCl đậm đặc vào cặn, thêm nước sơi và cho qua lọc, hứng dung dịch qua lọc trong một bình định mức 250ml, rửa giấy lọc với nước nĩng, để nguội dung dịch rồi thêm nước tới vạch.
Hút 20ml (V’) dung dịch này cho vào bình tam giác, acid hố bởi HCl đậm đặc với sự hiện diện của 1 giọt Heliantin. Để đun sơi và làm tủa ion SO
4 2-
bởi dung dịch BaCl
2, ta thêm từng giọt BaCl
2 vào, để tủa lắng xuống sau mỗi lần thêm. Sau một giọt BaCl
2 khơng cho tủa nữa, để yên, lọc và rửa tủa BaSO
4 cẩn thận với nước sơi. Làm bốc hơi dung dịch qua lọc và nước rửa đựng trong bát sứ cĩ mỏ ở nồi chưng cách thủy cho đến khi thể tích cịn khoảng 20ml. Thêm vào 2ml HClO
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 60
đặc và tiếp tục cho bốc hơi đến khi chất cặn gần như khơ. Thêm vào 15ml nước cất nĩng, 1ml HClO
4 và cho bốc hơi trên nồi chưng cách thủy lần thứ 2 cho đến khi đặc lại. Lúc bấy giờ đun trên nồi đun cát cho đến khi khơng cịn mùi HCl và cĩ khĩi trắng nhưng tránh đừng để khơ.
Để nguội lại, thêm 15ml cồn 96o cĩ chứa 0,2% HClO
4 và khuấy với đũa khuấy cĩ đầu bằng. Để yên cho tủa lắng xuống và gạn phần lỏng ở trên qua phễu buchner hay phễu lọc thủy tinh cĩ màng xốp. Rửa như vậy 2 – 3 lần, mỗi lần 2 – 3 giọt alcol percloric nhưng cẩn thận khơng để tủa qua lọc.
Chất tủa KClO
4 ít nhiều cĩ lẫn trong muối khác. Người ta làm tinh khiết bởi sự kết tinh lại. Đun bát sứ ở nồi chưng cách thủy để loại alcol, hịa tan những tinh thể trong 1 lít nước nĩng, thêm vài ml HClO
4 và cho bốc hơi đến khi cĩ khĩi trắng. Sau khi để nguội, chuyển kết tủa tinh khiết của KClO
4 sang chén sứ nhỏ nhờ một tia alcol percloric (chứa trong bình xịt), tráng 1 lần nữa với alcol percloric, sau cùng với 2 – 3ml alcol tinh khiết. Thể tích chung khơng được quá 75ml. Đem sấy khơ chén sứ cĩ chứa chất trầm hiện trong tủ sấy ở 120 – 130oC cho tới khi trọng lượng khơng đổi và cân sau khi để nguội trong bình hút ẩm. Sau đĩ rửa chén sứ với nhiều nước nĩng , sấy khơ ở 120 – 130oC, cân lại sau khi để nguội trong bình hút ẩm. Hiệu số giữa hai lần cân là trọng lượng chính xác của KClO4.
2.2.8.4. Tính tốn kết quả
Khối lượng của Kalium tổng sốđược xác định theo cơng thức sau: '39(/g mẫu khơ)'138.5KPxVmgPxV=
Trong đĩ:
P’ : trọng lượng KClO
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 61
P : trọng lượng mẫu khơ (g)
V : dung dịch sau khi vơ cơ hĩa (ml)
V’ : thể tích dung dịch dùng đểđịnh phân (ml) 39 : khối lượng nguyên tử K
138.5: khối lượng phân tử KClO
4.
2.2. 9 Phương Pháp Xác Định Hoạt Độ Enzym Catalase 2.2.9.1. Nguyên tắc
Đểđịnh lượng catalase cĩ thể dùng KMnO
4 0.1N để xác định lượng H
2O
2 trước và sau khi enzyme tác dụng, từđĩ tính được lượng H
2O
2 đã bị thủy giải. 5H2O2 + 2KmnO4 + 3H2S04 2MnO4 + K2SO4 + SO2 + 8H2O
Từ phương trình phản ứng này ta tính được 1ml dung dịch KMnO
4 0.1N tương ứng với 1.7mg H 2O 2. 2.2.9.2. Tiến hành thí nghiệm Dụng cụ, hĩa chất Bột thủy tinh. CaCO 3. KMnO 4 0.1N. H 2SO 4 10%. H 2O 2 0.1% trong đệm phosphate pH 7.0.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 62 Cối chày sứ. Buret. Bình định mức. Erlen. Bểổn nhiệt. Tiến hành
Cân 2g mẫu tươi cho vào cối, nghiền với cát thủy tinh. Thêm từ từ 2 -3ml nước cất và một ít (khoảng 0.3g) CaCO
3 để trung hịa dịch chiết ( đến khi ngừng tạo bọt CO
2). Chuyển tồn bộ mẫu vật đã nghiền vào bình định mức 100ml, thêm nước đến 100ml.
Lắc đều và để lắng khoảng 30 phút. Lọc thu dịch trong
Xác định hoạt độ catalase: lấy 2 erlen
− Bình 1 (thử thật): cho vào 20ml dịch enzyme và 25ml H
2O
2 0.1%
− Bình 2 (thử khơng) : cho 20ml dịch enzyme, đun sơi cách thủy trong 3 phút. Sau đĩ thêm 25ml H
2O
2 0.1%.
Đặt cả hai bình vào bể ổn nhiệt ở 30
0
C. sau 30 phút thêm vào mỗi bình 3ml H
2SO
4 10% và chuẩn độ bằng KMnO
4 0.1N đến khi cĩ màu hồng xuất hiện và bền trong một phút.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 63 2.2.9.3 Cách tính tốn kết quả
Số lượng H
2O
2 được giải phĩng bởi enzyme trong 1g mẫu là
Với : V 0: thể tích KMnO 4 dùng trong bình thử khơng (ml) Vt: thể tích KMnO 4 dùng trong bình thử thật (ml). m: khối lượng mẫu sử dụng ( g).
sốđơn vị catalase trong một gam mẫu/μmol H
2O
2 được giải phĩng sau một phút là:
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 64 CHƯƠNG 3
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 65 3.1. Kết quảđiều tra - đánh giá bệnh
3.1.1. Tỷ lệ bệnh
Sau 5, 10, 15, 20, 25 ngày lây nhiễm ở các nghiệm thức, ta được kết quả sau:
Bảng 3.9. Kết quả tỷ lệ bệnh
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 66
Từ 5 ngày xử lý thuốc trở về sau thì tỷ lệ nhiễm bệnh ở cây lúa được sử dụng thuốc đặc trị giảm nhanh nhất. Ở cây lúa sử dụng Exin R và cây lúa khơng dùng thuốc thì tỷ lệ bệnh vẫn tiếp tục tăng cao và luơn duy trì ở mức gần như ngang nhau.
3.1.2. Chỉ số bệnh
Sau 5, 10, 15, 20, 25 ngày lây nhiễm ở các nghiệm thức, ta được kết quả sau:
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 67 Nhận xét
Ở lơ cĩ xử lý thuốc đặc trị: sau 10 ngày chỉ số bệnh bắt đầu giảm và giảm mạnh sau 25 ngày được xử lý.
Ở lơ cĩ xử lý Exin: chỉ số bệnh vẫn tăng ít cho đến ngày thứ 20, sau đĩ bắt đầu giảm.
Trong khi đĩ ở lơ đối chứng chỉ số bệnh vẫn tăng cao theo thời gian.
3.2. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại
Sau khi phân tích phổ hồng ngoại ta được kết quả sau
Bảng 3.11. Kết quả phân tích hồng ngoại
Nhận xét
Sau khi tiến hành phân tích phổ hồng ngoại ở tất cả các mẫu lúa trong quá trình thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy trong tất cả các mẫu lúa được phân tích cĩ sự hiện diện của các nhĩm chức sau: Nhĩm – OH ; NH
3; các anhydride thơm, các nhĩm quinone, nhĩm – C = C – một nhân thơm (arene), các hợp chất Phenol orto, para, meta; và các hợp chất nhiều nhân thơm (aryl).
Các chất chất này hiện diện trong các mẫu lúa thí nghiệm với cường độ (AU) rất khác nhau. Cụ thể như sau:
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 68 NH
3: (Bước sĩng: 2917,478 và 2849,55 cm-1).
Nhận xét
Ở các lơ bị nhiễm bệnh, hợp chất NH
3 biểu hiện khá cao. Cao nhất là ở lơ bị nhiễm khơng được xử lý thuốc đặc trị và chế phẩm Exin R (0,273AU). Ở lơ bị bệnh cĩ xử lý thuốc đặc trị thì thấp hơn (0,174AU) nhưng vẫn cao hơn lơ bị bệnh được xử lý với Exin R (0,107AU).
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 69
Hợp chất NH
3 biểu hiện thấp nhất là ở lơ đối chứng khơng cho lây nhiễm bệnh (0,026AU).
Nhĩm Anhydride thơm: (Bước sĩng: 1735,246 cm-1).
Nhận xét
Chỉ cĩ hai nghiệm thức cĩ xuất hiện nhĩm anhydride thơm là lơ nhiễm bệnh khơng xử lý thuốc và Exin R (0,088AU) và lơ bị nhiễm được xử lý thuốc đặc trị (0,049AU).\
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 70 Nhĩm Quinone: (Bước sĩng: 1647,666cm-1).
Nhận xét
Nhĩm chức quinone khơng thấy xuất hiện ở lơ bị bệnh đã xử lý thuốc nhưng lại xuất hiện cao nhất ở lơ bị nhiễm cĩ xử lý Exin R (0,216AU). Ở các lơ khơng xử lý thuốc và chế phẩm Exin R, dù cĩ bệnh hay khơng cĩ bệnh, nhĩm chức quinone vẫn xuất hiện với cường độ thấp.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 71 Nhĩm C = C một nhân thơm (arene): (Bước sĩng: 1459,488 và 1379,79
cm-1).
Nhận xét
Nhĩm arene xuất hiện thấp ở các lơ cĩ xử lý Exin R (0,011AU và 0,010AU). Ở các lơ bị bệnh khơng xử lý thuốc đặc trị và Exin R nhĩm này xuất hiện với