2. Bệnh khơ vằn trên lúa
4.3. Quá trình tổng hợp Salicylic acid trong cây
Các nhà khoa học đã xác định được quá trình sinh tổng hợp Sa trong cây và vai trị tín hiệu nội bào trong động vật bậc cáo và cả hai nhánh này đều bắt nguồn từ Phenilalanin. Sự tương hợp của Cinamic từ Phenilalanin đã được biết đến từ lâu và sản phẩm của nĩ là những Isoflanoid, phytoalexin, lignin cũng quyết định đến cơ chế tính kháng của cây.
Rõ ràng sản phẩm Salicilic acid là một con đường khác để trả lời câu hỏi: tại sao sự xâm nhập của ký sinh làm cho ký chủ hiểu được là ký sinh nào?
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 43
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 44
CHƯƠNG 2
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 45 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Giống lúa VN 99-3: Giống lúa này do phịng cây lương thực thuộc viện Khoa Học Kỹ Thuật Nơng Nghiệp Miền Nam cung cấp. Đây là giống lúa cĩ tính kháng rất kém đối với các bệnh khơ vằn và các bệnh khác.
2.1.2. Nấm bệnh: Chủng Rhizoctonia solani do phịng bảo vệ thực vật Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nơng Nghiệp Miền Nam phân lập từ các mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh từ Học Kỹ Thuật Nơng Nghiệp Miền Nam phân lập từ các mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh từ các cánh đồng ởđồng bằng sơng Cửu Long cung cấp.
2.1.3. Exin R: Chế phẩm phịng bệnh trên lúa do Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp.
2.1.4. Vivadamy SDD: Với hoạt chất Validamycin – A ở nồng độ 5%, đây là loại thuốc cĩ tác dụng đặc biệt hữu hiệu trong phịng trừ bệnh khơ vằn hại lúa.
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Phương pháp phân lập nấm bệnh
Các mẫu lúa cĩ các triệu chứng của bệnh khơ vằn được thu thập từ những cánh đồng ởđồng bằng sơng Cửu Long.
Rửa mẫu sơ qua dưới vịi nước khoảng 2 phút để loại bỏ các tàn dư hữu cơ. Cắt mẫu thành những mảnh nhỏ khoảng 2 – 5mm.
Rửa các mảnh này khoảng 3 lần trong nước cất vơ trùng (mỗi lần một phút) và thấm khơ bằng khăn giấy vơ trùng.
Chuyển các mẫu này lên mơi trường nước agar (agar water) 2% cĩ chứa 100μg/ml Streptomycin Sulfate để loại bỏ sự nhiễm khuẩn.
Khi nấm mọc lên thì tiếp tục chuyển sang mơi trường PGA (potato glucose agar) để tiếp tục nhân sinh khối của nấm lên.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 46 2.2.2. Phương pháp tạo giá thểđể cấy nấm 2.2.2.1. Vật liệu - Hạt lúa hoặc hỗn hợp trấu:gạo (1:2). - Bột bắp. - Túi nhựa chịu nhiệt. 2.2.2.2. Cách tiến hành
Lúa được nấu chín ở 100oC trong khoảng 1 giờ.
Lúa sau khi nấu chín được trộn với bột bắp theo tỷ lệ 2 lúa: 1 bột bắp.
Chuyển hỗn hợp này vào túi nhựa, hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
Để nguội, sau đĩ cấy nấm vào giá thể, ủở nhiệt độ phịng trong 4 – 5 ngày.
Khi thấy sợi nấm mọc đầy giá thể thì đem rải đều xuống ruộng lúa cho nhiễm.
2.2.3. Phương pháp điều tra, đánh giá bệnh trên cây lúa
Điều tra theo dõi bệnh cây nhằm phát hiện và xác định được tình hình phát sinh, mức độ phát triển và đặc điểm biến động của bệnh lúa.
Phương pháp điều tra, đánh giá là đếm tất cả các cây lúa bị bệnh trên tổng số cây trong một lơ. Số lượng cây lúa điều tra trên một lơ là 420 – 440 cây. Đánh giá sự phát sinh, phát triển, mức độ bệnh bằng các chỉ tiêu: tỷ lệ bệnh, tốc độ tăng trưởng của bệnh theo thời gian (r), hiệu quả phịng trừ bệnh ( Q, %).
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 47 2.2.3.1. Tính tỷ lệ bệnh
Xác định mức độ phổ biến chung của bệnh (tần số thường gặp của bệnh) TLB (%) theo cơng thức:
Trong đĩ: A – số lượng cây bị bệnh. B – số lượng cây điều tra.
2.2.3.2. Tính chỉ số bệnh
Để tính chỉ số bệnh cần phải điều tra các cá thể theo bảng phân cấp bệnh quy ước để phân định rõ ràng mức độ bệnh nghiêm trọng khác nhau của chúng.
Tính chỉ số bệnh theo cơng thức Townsend – Heuberger
Trong đĩ a – số lượng cá thể bị bệnh ở mỗi cấp. b – trị số cấp bệnh ở mỗi cấp tương ứng. - tổng số của các tích a.b. (.)abΣ
N – tổng số cá thểđiều tra.
T – trị số cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp bệnh dã dùng (trong trường hợp điều tra về bệnh khơ vằn quy ước T = 9).
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 48 2.2.4. Phương pháp phân tích trên phổ hồng ngoại
2.2.4.1. Nguyên tắc
Sự định tính này dựa trên các mũi và sự thể hiện với mật độ ít hay nhiều trên phổ, ta xác định được nhĩm chức nào mới xuất hiện. 2.2.4.2. Dụng cụ và hĩa chất Dụng cụ Ống nghiệm. Erlen . Cối phá mẫu. Giấy lọc. Ống hút. Hĩa chất Cát thạch anh. Chloroform đậm đặc. 2.2.4.3. Tiến hành
Lấy 2 gam mẫu tươi nghiền nhỏ với cát thạch anh, cho thêm 10ml chloroform đậm đặc vào và nghiền tiếp. Tiếp tục lọc dịch chiết qua giấy lọc dưới ống nghiệm.
Đem đi đo phổ ở phịng Phân Tích Hĩa Lý ở Viện Khoa Học và Cơng Nghệ Miền Nam, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 49 2.2.5. Phương pháp định lượng đường tổng số
2.2.5.1. Nguyên tắc
Sựđịnh phân này căn cứ vào phản ứng đặc trưng của đường và nhiều chất hữu cơ (phenol) với sự hiện diện của H 2SO 4. 2.2.5.2. Dụng cụ và hĩa chất Dụng cụ Bình định mức 500ml, 100ml, 50ml. Cốc hay bình tam giác 50ml, 100ml. Cối chày sứ. Phễu lọc. Ống nghiệm. Ống hút. Quang phổ kế. Hĩa chất Cồn 96o.
Cồn 80o (80ml cồn tuyệt đối hịa tan trong 100ml nước). Phenol 5% (5g mới cất hịa trong 100ml nước cất). Dung dịch H
2SO
4 60%.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 50
- Saccarose 0,1%: 500mg saccarose sấy khơ ở 60oC hịa tan trong 500ml nước cất.
- Glucose 0,01%: 0,01mg glucose hịa tan trong 100ml nước cất. - Glucose 0,2mg/ml: 0,1g glucose hịa tan trong 500ml nước cất.
2.2.5.3. Tiến hành Trích đường
Lấy 1 – 2 gam nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50mg đường cho vào cốc thủy tinh 50ml và thêm 10ml cồn 96o vào (nếu dùng nguyên liệu khơ thì lấy ít mẫu hơn). Sau đĩ để cốc đun trên nồi cách thủy cho sơi 3 lần.
Khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Sau khi để nguội, lọc qua giấy lọc khơng tro, khi lọc chỉ cần lấy phần rượu.
Sau đĩ cho tiếp 10ml cồn vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun 2 lần tới sơi trong nồi cách thủy. Để nguội lại lọc tiếp tục , chiết rút như vậy khoảng hai lần, xong đưa bã lên lọc và rửa 2 – 3 lần bằng cồn 80o nĩng.
Cồn qua lọc cho bay hơi ở trong phịng hay trên nồi cách thủy. Sau khi cho bay hơi cồn thì mẫu cĩ thểđể lâu trong bình hút ẩm.
Cặn khơ trong cốc được pha lỗng với 50ml nước cất. Nếu cĩ cặn thì đễ lắng xuống.
Khi đem làm hiện màu, dung dịch này cĩ thểđược pha lỗng 5 – 10 lần tùy theo nồng độ cao hay thấp.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 51
Hút 1ml dung dịch đường cĩ khoảng 10 – 70μg đường cho vào ống nghiệm và thêm vào 1ml dung dịch phenol 5%. Sau đĩ cho vào ống nghiệm 5ml H
2SO
4 đậm đặc. Tuyệt đối khơng để dây axit vào thành ống.
Để yên 19 phút rồi lắc và để yên trên bểổn nhiệt từ 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ.
Xác định màu trên quang phổ kếở bước sĩng 490nm.
Xây dựng đồ thị mẫu
Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào đĩ theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7ml dung dich saccarose mẫu 0,1% nĩi trên, cho nước tới vạch mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm rồi nhuộm bằng phenol và H
2SO
4 như trên.
Mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70μg saccarose. So màu và vẽđồ thị mẫu, luơn phải làm kèm với một ống thử trắng bằng 1ml nước cất thay cho dung dịch đường.
Độ chính xác của phương pháp này là ± 0,2%.
2.2.6. Phương pháp định lượng nitơ tổng số 2.2.6.1. Nguyên tắc 2.2.6.1. Nguyên tắc Dưới tác dụng của H 2SO 4 đặc và các chất xúc tác, tất cả các dạng đạm hữu cơ được chuyển thành NH 4 + . Đẩy NH 4 + bằng dung dịch kiềm và hứng NH 3 thốt ra bằng dung dịch axit. 2.2.6.2. Dụng cụ và hĩa chất Hĩa chất
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 52 H 3BO 4 4%. HCl 0,25. H 2SO 4 đậm đặc. NaOH 32%. Methyl đỏ. Bromocresol xanh lá. Cồn 96o. Nước cất. Dụng cụ Bộ phá mẫu Kjeldahl. Bếp đun. Cối chày sứ. Bình định mức, bình tam giác, ống hút. Máy cất đạm Parnas Wargner.
2.2.6.3. Tiến hành
Quá trình định lượng Nitơ tổng sốđược tiến hành theo trình tự 3 bước sau
Bước 1: Xác định và phá mẫu
Cân 0,2 gam mẫu đã sấy khơ, nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 gam chất xúc tác và 5ml dung dịch H
2SO
4 đậm đặc, nối vào bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 53
Khi thời gian phá mẫu kết thúc, đễ ống phá mẫu nguội (khoảng 5 phút), bổ sung 10ml nước cất, trộn đều, để nguội và lắc vào máy chưng cất.
Bước 2: Chưng cất mẫu
Lắp ống phá mẫu vào bộ chưng cất, bổ sung thêm 30ml dung dịch NaOH 32%. Khởi động qui trình chưng cất, dịch chưng cất được thu nhờ bình thu cĩ bổ sung trước axit boric 4% và hỗn hợp chất chỉ thị. Ngừng cất khi thu được khoảng 125 – 150ml dịch chưng cất.
Bước 3: Chuẩn độ
Chuẩn độ bằng HCl 0,25N. Dừng chuẩn độ khi phát hiện màu phớt đỏ.
2.2.6.4. Tính tốn
Thơng qua số HCl 0,25N; người ta biết được lượng axit boric kết hợp với NH
3
và do vậy biết được số lượng NH
3 giải phĩng từ mẫu: trung bình cứ 1ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035g Nitơ hữu cơ. Kết quả tính tốn thể hiện theo Nitơ hữu cơ hoặc Nitơ tổng số.
Phần trăm Nitơ tổng (%): thơng thường protein chứa khoảng 16% N. Khí NH
3
nhận được khi chưng cất nhân với hệ số qui đổi là 100/16 ≅ 6,25 sẽ cho biết giá trị protein tương đương ( hay NH
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 54 2.2.7. Phương pháp định lượng phospho tổng số bằng quang phổ kế
Xác định hàm lượng phospho trong giới hạn nồng độ từ 1 – 20mg/cm3.
2.2.7.1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa vào khả năng của ion orthophosphate phản ứng với amonium molybdate tạo thành phosphomolybdate, phức chất cĩ màu xanh lơ.
2MoO 2.4MoO 3 + H 3PO 4 ⎯⎯⎯→ (MoO 2.4MoO 3)2H 3PO 4.4H 2O
Hàm lượng phospho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu đo ở bước sĩng hấp thu cực đại 650nm với cuvet cĩ chiều dài 10mm. Dung dịch đối chứng là dung dịch khơng.
2.2.7.2. Dụng cụ và hĩa chất Dụng cụ
Do phương pháp cĩ độ nhạy cao nên các dụng cụ thủy tinh địi hỏi phải thật sạch.
Bình định mức 50ml, 100ml.
Ống nghiệm cĩ l = 150mm và φ = 15mm.
Máy quang phổ kế và cuvet 10mm.
Hĩa chất
Tất cả các hĩa chất sử dụng trong thử nghiệm này phải đạt độ tinh khiết phân tích.
Nước sử dụng phải là nước cất hai lần. HCl đậm đặc.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 55 HNO 3 đậm đặc. Amoni molybdate. Hydroquinone [C 6H 4(OH) 2], pha khi sử dụng. Kali dihydrophosphate (KH 2PO 4).
Sodium sunphic (Na
2SO
3).
2.2.7.3. Tiến hành
Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 4325-86. Nếu mẫu khơ khơng khí, xử lý sơ bộ và bảo quản.
Nếu mẫu tươi, xử lý sơ bộ, cơ cạn , sấy ở 60oC, sấy ở 105oC, nghiền lấy mẫu trung bình.
Chuẩn bị dung dịch thuốc thử
Dung dịch 1: dung dịch chuẩn gốc (chứa 100μg phospho/ml). Hịa tan 1,4394 gam KH
2PO
4 trong bình định mức 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000 ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (chứa 25μg phospho/ml). Lấy 25ml dung dịch cho vào bình định mức 100ml và định mức bằng nước cất đúng 100ml, ta cĩ dung dịch 1A. Dung dịch HCl 10%: 250ml HCl đậm đặc cộng với 750ml nước cất. Dung dịch 2: Dung dịch Na 2SO 3 20%: cân 20 gam Na 2SO
3 hịa vào trong 100ml nước cất. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 56 Dung dịch 3: dung dịch hydroquinone 0,5%. Hịa tan 0,5 gam hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H
2SO
3, thêm tiếp nước cho đủ 100ml. Dung dịch chuẩn bi khi sử dụng.
Dung dịch 4: Thuốc thử Briggs hay dung dịch amoni molybdate 5%. Hịa tan 50 gam amoni molybdate trong 100ml nước cất. Cho 150ml H
2SO
4 đậm đặc vào trong 400ml nước. Để nguội thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% đã chuẩn bị vào hỗn hợp, để nguội thêm nước cho đủ 1000ml.
Hỗn hợp thuốc thử: trộn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1:1:1.
Chuẩn bị dung dịch tro phân tích
Cân chính xác 1 – 5 gam mẫu (tùy theo mẫu cĩ phospho nhiều hay ít).
Vơ cơ mẫu ở 550oC trong 4 giờ. Để nguội. Thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất
và thêm 10ml dung dịch HCl 10% và 0,5ml HNO
3 đậm đặc.
Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phịng. Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 250ml bằng nước cất.
Phản ứng lên màu
4. Lấy 10ml dung dịch tro cho vào bình hình nĩn dung tích 100ml, định mức cho đủ 100ml ta cĩ dung dịch thứ 2.
5. Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào trong ống nghiệm.
6. Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử + nước cất cho đủ 10ml. Trộn đều hỗn hợp, để 30 phút. Đo ở bước sĩng 650nm.
Tiến hành dựng đồ thịđường chuẩn
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 57
X (mgP) = (Abs * 0.0057)/ 0.0109
Abs : là giá trị mật độ quang của dịch thửđo ở bước sĩng 650nm
2.2. 7. 4 Tính tốn kết quả
Trong đĩ:
X: sốμg P cĩ trong dịch thử. V
ddtro: thể tích dung dịch sau khi tro hĩa. m: khối lượng mẫu thử (g).
106 : hệ số chuyển đổi từ g sang μg. V : thể tích thử.
Sai số giữa hai lần phân tích song song với độ tin cậy p = 0.95 khơng vượt quá d =28 ( 0.05 + 0.031X)%.
2.2.8. Phương pháp định lượng kali tổng số 2.2.8.1. Nguyên tắc
Dung dịch acid percloric (HClO
4) làm trầm hiện Kalium dưới dạng perclorat. Kết tinh lại để loại chất bẩn. Sấy khơ và cân trọng lượng KClO
4, từ đĩ suy ra hàm lượng Kalium.
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 58 2.2.8.2. Dụng cụ và hố chất Dụng cụ Chén sứ nung. Bếp đun cách thủy. Bình định mức 250ml. Phễu lọc Bucher. Ống hút 1ml, 3ml, 5ml. Tủ say, bếp cách cát. Cân phân tích đến 0.0001g. Hĩa chất HCl đậm đặc. HClO 4 tinh khiết. Heliantin. Dung dịch BaCl
2 25%: Cho 250 gam BaCl
2 vào bình định mức 1000ml sau đĩ cho nước vào đến vạch định mức để hồ tan.
Dung dịch cồn 96o chứa 10ml HClO
4 trong 1000ml cồn. Cồn 96
o
SVTH: Nguyễn Trí Hiếu 59 2.2.8.3. Tiến hành:
• Cơng phá mẫu
Cân 0.2g mẫu đã sấy khơ hồn tồn, cho vào bình Kjeldahl, thêm 3-4ml dung dịch H
2SO
4 đậm đặc sao cho vừa ngập mẫu. Ngâm mẫu trong acid qua vài giờ (khoảng 4 giờ). Trong quá trình vơ cơ hĩa, các nguyên tố khống biến đổi dần thành các dạng oxid. Sau đĩ thêm vào bình vài giọt H
2O
2. đặt bình trên bếp điện, đun nĩng từ từ, tránh bếp nĩng đỏ làm nguyên liệu bắn lên thành bình và bị bắn ra ngồi(cĩ thể đặt bình trên lưới amiant). Khoảng 30 phút sau, tắt bếp, để nguội và cho thêm vài giọt H
2O
2, rồi đun tiếp. Lần này dung dịch chuyển sang màu cánh gián, đun trong 30 phút, để nguội, cho thêm khoảng 5 giọt H
2O
2 nữa rồi tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trắng hẳn.
• Định lượng Kalium
Cho vài giọt HCl đậm đặc vào chất cặn cịn lại từ dịch vơ cơ hố. Cho bốc hơi trên nồi chưng cách thủy. Lập lại thao tác như trên lần thứ 2. đun sơi chất cặn cịn lại ở 110 – 120oC trong 30 phút để làm silice hồn tồn khơng hồ tan, cho 1 giọt HCl