Thí nghiệm được tiến hành với 2 nguồn photpho là KH2PO4 và K2HPO4.3H2O lấy nồng độ KH2PO4 5g/l làm chuẩn. Mẫu đối chứng không bổ sung photpho. Lên men lắc 150v/p; ở 300C trong 24 giờ. Sự sinh trưởng của giống được xác định dựa trên giá trị OD ở bước sóng 600nm và hàm lượng đường dư trong dịch sau lên men.Kết quả được thể hiện ở hình 21.
Kết quả hình 21 cho thấy: Với cùng chủng giống và cùng tỷ lệ giống bổ sung, cùng điều kiện thí nghiệm mẫu sử dụng K2HPO4.3H2O cho sinh khối cao nhất. Vì vậy, K2HPO4 được lựa chọn như nguồn cung cấp phospho để nuôi sinh khối chủng Y.7028. Để lựa chọn nồng độ K2HPO4 thích hợp, thí nghiệm được tiến hành với nồng độ K2HPO4 bổ sung thay đổi từ 0,2 -1g/l. Sau 24 giờ lên men ở 300C, lắc 150v/p, sự sinh trưởng của giống được xác định dựa trên giá trị OD ở 600nm và hàm lượng đường dư trong dịch sau lên men. Kết quả được thể hiện ở hình 22.
Hình 22. Ảnh hưởng của nồng độ K2HPO4 đến sinh trưởng của chủng Y.7028
Kết quả ở hình 5 cho thấy: Nồng độ K2HPO4 có ảnh hưởng đến sinh trưởng và tạo sinh khối của chủng Y.7028. Trong khoảng từ 0 – 0,6g/l, sinh khối tạo thành tăng tỷ lệ thuận với sự tăng nồng độ K2HPO4 bổ sung vào môi trường. Giá trị OD đạt cao nhất và lượng đường dư thấp nhất khi nồng độ K2HPO4 bổ sung là 0.6 g/l. Vì vậy, nồng độ K2HPO4 0.6g/l được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.5 Ảnh hưởng của magie (MgSO4.7H2O)
Magie có vai trò như một cofactor tham gia vào nhiều phản ứng enzim liên quan tới các quá trình phosphoryl hóa, do vậy, nó ảnh hưởng không nhỏ tới sinh trưởng của nấm men. Để nghiên cứu ảnh hưởng của magie, môi trường lên men thu sinh khối được bổ sung MgSO4.7H2O ở các nồng độ: 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 g/l. Mẫu đối chứng là môi trường không bổ sung magie. Lên men ở 300C, lắc 150vòng/phút trong 24 giờ. Xác định sự tạo thành sinh khối và đường dư. Kết quả được thể hiện ở hình 23.
* Độ pha loãng 150 lần.
Hình 23. Ảnh hưởng của MgSO4.7H2O đến sinh khối
Kết quả ở hình 23 cho thấy: MgSO4 có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp tế bào, giá trị OD ở các mẫu bổ sung MgSO4 cao hơn hẳn mẫu đối chứng không bổ sung magie. Trong số 5 nồng độ MgSO4 thí nghiệm, nồng độ MgSO4 bổ sung 1 g/l cho kết quả cao nhất. Do đó, hàm lượng MgSO4 1 g/l được lựa chọn cho những thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.6 Ảnh hưởng của cao nấm men
Cao nấm men ngoài vai trò cung cấp nitơ hữu cơ còn là nguồn nhân tố sinh trưởng, đặc biệt là vitamin nhóm B. Để nghiên cứu ảnh hưởng của cao nấm men tới sinh trưởng của chủng nghiên cứu. Các nồng độ của chất này được bổ sung vào môi trường là 1; 2; 3; 4; 5 và 6 g/l, mẫu đối chứng không bổ sung cao nấm men;. Xác định lượng sinh khối tạo thành và hàm lượng đường dư trong dịch nuôi sau 24 giờ, lắc 200 vòng/phút ở 30oC. Kết quả thể hiện trong hình 24.
* Độ pha loãng 150 lần.
Kết quả ở hình 24 cho thấy, nồng độ cao nấm men có ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng của chủng CNTP 7028. Lượng sinh khối tạo thành tăng dần theo lượng cao nấm men bổ sung vào môi trường và đạt mức cao nhất ở nồng độ 5g/l. Tại nồng độ này, lượng đường dư cũng là thấp nhất. Do đó, nồng độ cao nấm men 5g/l được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.7 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng của chủng chọn lựa
Thí nghiệm được tiến hành với các tỷ lệ nitơ, magie, photpho và cao nấm men đã lựa chọn, ở nhiệt độ 30˚C trong 24 giờ ,với 3 tốc độ lắc khác nhau: 150; 200 và 250 vòng/phút. Mẫu đối chứng không lắc. Phân tích lượng sinh khối tạo thành và hàm lượng đường dư trong dịch sau lên men. Kết quả được thể hiện ở hình 25.
* Độ pha loãng 150 lần.
Hình 25. Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sự sinh trưởng của chủng Y.7028
Kết quả ở hình 25 cho thấy: Tốc độ lắc có ảnh hưởng khá nhiều đến sinh trưởng của chủng nghiên cứu. Tốc độ lắc càng lớn thì lượng sinh khối thu được càng tăng. Tại tốc độ lắc là 250 v/p cho lượng sinh khối lớn nhất, đường sót thấp nhất nên được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.8 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình tạo sinh khối chủng chọn lựa kí hiệu Y.7028 lựa kí hiệu Y.7028
Chủng nấm men Y.7028 được nuôi cấy trên bình lên men Bioflo và thông khí trong suốt quá trình nuôi cấy. Kết quả được thể hiện ở hình 26.
* Độ pha loãng 100 lần
Hình 26. Động học của quá trình tạo sinh khối của chủng Y.7028
Kết quả ở hình 26 cho thấy khoảng thời gian nuôi cấy từ 0- 20 giờ, lượng sinh khối thu được tăng tỉ lệ nghịch với sự giảm hàm lượng đường trong môi trường. Ở thời điểm 20 giờ, tế bào nấm men sinh trưởng gần như cực đại, hàm lượng đường trong môi trường cũng gần như cạn kiệt. Sau 20 giờ nuôi cấy, lượng sinh khối thu được không những không tăng mà giảm chút ít. Như vậy, thời điểm 20 giờ được lựa chọn để thu hồi sinh khối chủng Y.7028.
Kết luận: Từ các kết quả thực nghiệm đã xác định được điều kiện để tạo sinh khối chủng nấm men Y 7028 tốt nhất như sau: Glucoza 60g/l; (NH4)2SO4 3g/l, K2HPO4 0,6g/l, MgSO4.7H2O 1 g/l, cao nấm men 5 g/l, pH 5,0, thông khí 1 vvm, nhiệt độ 30oC, thời gian lên men 20 giờ.
3.5 Nghiên cứu sản xuất bánh men theo phương pháp truyền thống kết hợp với việc bổ sung các vi sinh vật thuần chủng đã chọn lựa qui mô phòng thí nghiệm và việc bổ sung các vi sinh vật thuần chủng đã chọn lựa qui mô phòng thí nghiệm và qui mô gia đình
3.5.1 Nghiên cứu sản xuất bánh men qui mô phòng thí nghiệm 3.5.1.1 Xác định tỷ lệ nấm men, nấm mốc bổ sung 3.5.1.1 Xác định tỷ lệ nấm men, nấm mốc bổ sung
Chế phẩm nấm mốc và nấm men có được bổ sung vào bánh men với các tỷ lệ khác nhau. Nhận xét mẫu bánh men sau ủ và kiểm tra khả năng đường hóa và lên men rượu của bánh men sau khi sấy khô đến hàm ẩm 11-12%. Kết quả được ghi ở bảng 14
Bảng 14. Ảnh hưởng của tỷ lệ vi sinh vật đến quá trình đường hóa của bánh men TT Sach. (%) Mucor (%) Rhi. (%) Ory. (%) Nhận xét bánh men Đ tổng (g/l) EtOH %v/v Đg dư (g/l) Đường hóa cơm 1 0,5 0,5 0,5 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt mầu xám đen 72,63 6,0 0,72 Cơm mềm, nát, xẹp, ngọt, bề mặt hơi khô 2 1,0 0,5 0,5 0,5 Trắng, xốp nhẹ, bề mặt hơi nhăn 105,72 6,3 1,15 Cơm mềm, xẹp, hơi rời, ngọt, bề mặt hơi khô 3 1,5 0,5 0,5 0,5 Xốp nhẹ, trắng 1 vài chỗ có mầu xám, bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty 77,58 5,9 1,16 Cơm nát, xẹp, bề mặt khô, có ứa nước, ngọt 4 2,0 0,5 0,5 0,5 Xốp nhẹ, trắng 1 vài chỗ có mầu xám,
bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty 107,62 5,9 1,18 ứCa nơm nát, xước, ngẹọp, bt ề mặt khô, có 5 0,5 1,0 0,5 0,5 Xốp, nhẹ, nhăn, toàn bộ bề mặt phủ
lớp bào tử mầu xám đen 65,03 5,0 0,92 Cnhiơm xều bào tẹp, bửề mđen, bên dặt khô cứướng, i cơm mềm, ngọt nhẹ
6 0,5 1,5 0,5 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt phủ lớp khuẩn ty
với bào tử nâu nhạt 63,51 5,8 0,95 Ckhô, có ơm rất mứa nềm, nát, xước, ngọẹt p, bề mặt 7 0,5 2,0 0,5 0,5 Xốp nhẹ, trắng 1 vài chỗ có mầu xám,
bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty 155,91 5,9 1,29 Ckhô, ơm rứa ít nất ngọướt, nát, xc bên dẹp, bưới cề mốc ặt 8 0,5 0,5 1,0 0,5 Xốp nhẹ, men trắng 1 vài chỗ có mầu xám, bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty 77,58 6,1 1,00 Cơm hơi ngọt, nát, xẹp, bề mặt khô, 9 0,5 0,5 1,5 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt một vài chỗ có mầu xám đen 96,97 6,1 1,28 Ckhô, có ơm rất mứa nềm, nát, xước, ngọẹt p, bề mặt 10 0,5 0,5 2,0 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt chun gấp, nhiều
đám mầu xám đen hơn mẫu 8
79,10 6,0 0,98 Cơm rất mềm, nát, xẹp, bề mặt khô, có ứa nước, ngọt
11 0,5 0,5 0,5 1,0 Men xốp nhẹ, bề mặt có lớp khuẩn ty, mầu trắng.
71,11 5,9 0,92 Cơm không mềm, bề mặt khô, không ứa nước, có vị chua 12 0,5 0,5 0,5 1,5 Men xốp nhẹ, men trắng 1 vài chỗ có
mầu xám, bề mặt phủ lớp khuẩn ty
76,82 6,3 1,11 Cơm xẹp ít, bề mặt hơi khô, bên dưới ngọt có vị chua 13 0,5 0,5 0,5 2,0 Men xốp nhẹ, men trắng 1 vài chỗ có
mầu xám, bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty
91,65 6,3 1,46 Bề mặt cơm khô, có nhiều bào tử xanh, không ứa nước, không ngọt, có vị chua
14 1,0 1,0 0,5 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt chun gấp, một
vài chỗ có mầu xám đen 68,45 6,6 1,26 mCơặm rt không bất mềm, nát, xị khô, có ẹứp, ba ề nước, ngọt
15 0,5 0,5 1,0 1,0 Men xốp nhẹ, bề mặt có mầu xám đen 103,43 5,6 1,28 Cơm xẹp ít, bề mặt hơi khô, bên dưới cơm mềm, không ứa nước 16 0,5 1,0 1,0 0,5 Xốp nhẹ, phồng, bề mặt chun gấp, đám có mầu xám đen nhiều hơn mẫu 11 93,93 6,6 1,09 Cơm xẹp ít, bề mặt hơi khô, bên dưới cơm mềm, rất ngọt, có ứa nước 17 1,0 0,5 0,5 1,0 Xốp nhẹ, bề mặt hơi chun gấp, mầu trắng đẹp, 1 vài chỗ có mầu xám 97,73 6,6 1,44 Cơm xẹp ít, bề mặt khô, có bào tử xanh, bên dưới cơm không mềm, ngọt, có vị chua
18 1,0 1,0 1,0 1,0 Xốp nhẹ, bề mặt chun gấp, có đám
mầu đen, xám 79,10 6,7 1,46 Cbên dơm xướẹp ít, bi cơm không mề mặt hơi khô, ềm, ngọt, có vị chua
Kết quả ở bảng 14 và hình 27 cho thấy trong 18 mẫu thí nghiệm, mẫu số 14 với tỷ lệ Saccharomycopsis 1%, Mucor 1%, Rhizopus 0,5%, A.oryzae 0,5g%; và S. cerevisiae Y.7028 0,5% cho chất lượng bánh men tốt nhất. Bánh men trắng, hơi xám, xốp, thơm. Mẫu rượu lên men bằng bánh men số 14 cho độ rượu trong dấm chín khá cao (đạt 6,6%v/v) hàm lượng đường dư và axit tổng thấp. Vì vậy, tỷ lệ
Saccharomycopsis 1%, Mucor 1%, Rhizopus 0,5%, A.oryzae 0,5%; và S. cerevisiae
Y.7028 0,5%, được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.5.1.2 Xác định điều kiện ủ bánh men
a) Ảnh hưởng của hàm ẩm
Thí nghiệm được tiến hành với tỷ lệ Saccharomycopsis 1%, Mucor 1%,
Rhizopus 1%, A.oryzae 0,5% và S. cerevisiae Y.7028 0,5%, độ ẩm của bánh men thay đổi từ 50; 55 và 60%. Thời gian ủ 24 giờ ở 300C. Xác định số lượng tế bào vi sinh vật trong bánh men sau ủ. Kết quả được ghi ở bảng 15.
Bảng 15. Ảnh hưởng của độẩm đến số lượng vi sinh vật trong bánh men sau 48 giờ ủở 300C
Độ ẩm (%) Chủng vi sinh vật 50 55 60 Mucor (CFU/g) 1,2 x 103 2 x 104 1,3 x 105 Rhizopus (CFU/g) 1,5 x 103 3,5 x 104 3,2 x 105 A.oryzae (CFU/g) 2,5 x 104 1,5 x 103 1,1 x 102 Saccharomycopsis (CFU/g) 2,8 x 104 4,7 x 106 3,8 x 106 S.cerevisiae (CFU/g) 6,1 x 107 5,4 x 107 4,2 x 105
Kết quả ở bảng 15 cho thấy: Độ ẩm có ảnh hưởng đến sự phát triển của các chủng nấm mốc rất rõ rệt. Ba chủng Mucor, Rhizopus và Saccharomycopsis sinh trưởng tốt nhất khi hàm ẩm đạt 60% trong khi chủng A.oryzae sinh trưởng tốt với hàm ẩm là 50%. Tuy nhiên ở hàm ẩm 60% cả 4 chủng trên đều phát triển khá tốt. Vì vậy, hàm ẩm 60% được lựa chọn để trộn bánh men.
b) Ảnh hưởng của nhiệt độủ
Thí nghiệm được tiến hành với độ ẩm của bánh men 60%. Thời gian ủ 48 giờ, nhiệt độ ủ thay đổi lần lượt là: 300C, 320C và 350C. Sô lượng tế bào vi sinh vật trong bánh men sau ủ được xác định. Kết quả được ghi ở bảng 16.
Bảng 16. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới số lượng vi sinh vật trong bánh men
Nhiệt độ (0C) Chủng vi sinh vật 30 32 35 Mucor (CFU/g) 1,4 x 104 2,0 x 103 1,4 x 103 Rhizopus (CFU/g) 2,5 x 104 1,3 x 104 1,2 x 103 A.oryzae (CFU/g) 1,7 x 103 1,5 x 103 1,3 x 102 Saccharomycopsis (CFU/g) 2,8 x 106 2,4 x 106 1,8 x 105 S.cerevisiae (CFU/g) 3,1 x 106 2,5 x 106 3,2 x 105
Kết quả ở bảng 16 cho thấy: Sự phát triển của các chủng vi sinh vật trong bánh men chịu ảnh hưởng của nhiệt độ ủ. Cả năm chủng Rhizopus, Mucor, A.oryzae, Saccharomycopsis và S.cerevisiae đều sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 300C. Vì vậy, nhiệt độ 300C được lựa chọn để ủ bánh men.
c) Ảnh hưởng của thời gian ủ
Thí nghiệm được tiến hành với độ ẩm 60%, nhiệt độ ủ 300C, thời gian thay đổi từ: 0, 24; 36 và 48 giờ. Số lượng vi sinh vật trong bánh men sau ủ được xác định. Kết quả được ghi ở bảng 17.
Bảng 17. Ảnh hưởng của thời gian ủ tới số lượng vi sinh vật trong bánh men
Thời gian (giờ) Chủng vi sinh vật 0 24 36 48 Mucor (CFU/g) 1,7 x 103 1,8 x 104 1,5 x 105 1,3 x 105 Rhizopus (CFU/g) 1,2 x 104 1,3 x 105 1,6 x 106 1,4 x 106 A.oryzae (CFU/g) 1,2 x 103 1,7 x 103 1,8 x 103 1,8 x 103 Saccharomycopsis (CFU/g) 2,5 x 105 1,5 x 106 1,7 x 106 2,9 x 105 S.cerevisiae (CFU/g) 2,8 x 106 1,8 x 105 1,6 x 105 1,2 x 105 Kết quả ở bảng 17 cho thấy: Trong 24 giờ đầu của quá trình ủ bánh men, hai chủng Mucor và Rhizopus phát triển nhanh nhất, tiếp theo đến 48 giờ ủ chủng
Saccharomycopsis bắt đầu sinh trưởng mạnh, Chủng A. oryzae gần như không phát triển và chủng S. cerevisiae sinh khối không tăng và có phần hơi giảm trong suốt 48 giờ ủ. Dựa trên sự phát triển của hệ vi sinh vật trong bánh men, với độ ẩm môi trường 60%, nhiệt độ ủ 300C, thời gian ủ 24 giờ được lựa chọn.
3.5.1.3 Xác định chế độ sấy bánh men
Bánh men sau khi ủ được sấy khô ở các chế độ nhiệt khác nhau 400C; 450C và 500C đến hàm ẩm 11-12%. Xác định hàm ẩm và số lượng tế bào trong mẫu trước và trong quá trình sấy. Kết quả được ghi ở bảng 18 và 19.
Bảng 18. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm ẩm của bánh men
Hàm ẩm sau thời gian sấy (%) Nhiệt độ sấy
(0C)
Hàm ẩm trước sấy
(%) 6 giờ 12 giờ 18 giờ 24 giờ
40 16,8 15,53 14,21 13,75 12,07
45 16,8 14,72 13,62 12,24 11,56
50 16,8 13,21 12,36 11,45 11,27
Bảng 19. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến số lượng vi sinh vật trong bánh men
Nhiệt độ sấy (0C) 40 45 50 Chủng VSV Trước sấy Sau sấy Tế bào sống (%)
Sau sấy Tế bào sống
(%)
Sau sấy Tế bào sống (%) Mucor (CFU/g) 1,8 x 104 1,4 x 104 77,78 1,0 x 104 55,56 5,6 x 103 31,11 Rhizopus (CFU/g) 2,5 x 106 1,9 x 106 76,00 8,3 x 105 33,20 7,2 x 104 28,80 A.oryzae (CFU/g) 1,7 x 103 1,5 x 103 88,24 1,2 x 103 70,59 1,1 x 103 64,71 Saccharomycopsis (CFU/g) 1,6 x 105 1,2 x 105 75,00 7,4 x 104 46,25 1,9 x 102 11,88 S.cerevisiae (CFU/g) 1,8 x 105 1,1 x 105 61,11 7,5 x 104 41,67 2,2 x 102 12,22
Kết quả ở bảng 18 và 19 cho thấy: Sau 24 giờ sấy, hàm ẩm của bánh men giao động trong khoảng từ 11,27 – 12,07% và hàm ẩm này là phù hợp để bảo quản sản phẩm lâu dài. Tuy nhiên, nhiệt độ sấy ảnh hưởng rõ rệt đến số lượng vi sinh vật trong
bánh men. Số lượng tế bào vi sinh vật sống sót sau sấy tỷ lệ nghịch với sự tăng nhiệt độ