4 chủng kí hiệu BGO4, MHE6, BNR2A và BNM2 được sử dụng để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ, photpho, khoáng, nhiệt độ, pH, tốc độ thông khí, thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym.
3.3.4.1 Lựa chọn tỷ lệ cám:trấu:ngô thích hợp cho quá trình lên men tạo amylaza
Tỷ lệ cám trấu ngô trong môi trường không chỉ quyết định thành phần cacbon mà còn liên quan đến độ xốp và độ thoáng khí của môi trường. Sáu công thức với tỷ lệ cám: trấu: ngô khác nhau được sử dụng. Xác định hoạt tính enzym amylaza sau 48 giờ nuôi cấy ở 300C. Kết quả được trình bày ở hình 10.
Hình 10. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hoạt tính amylaza
Kết quả ở hình 10 cho thấy: Đối với chủng Mucor kí hiệu BNM2 môi trường MT4 có tỷ lệ Cám 70%: Trấu 20%: Ngô 10% là thích hợp nhất. Đối với chủng A.
nhất. Hai chủng còn lại là Rhizopus kí hiệu BNR2A và Saccharomycopsis kí hiệu MHE6 môi trương MT3 có tỷ lệ Cám 80%: Trấu 10%: Ngô 10% cho hoạt tính enzym amylaza cao nhất. Vì vậy, môi trường MT2, MT3 và MT4 được lựa chọn để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ, photpho, độ ẩm v.v đối với các chủng kí hiệu BGO4; BNR2A ; MHE6 và BNM2.
3.3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp amylaza
Ba nguồn nitơ sử dụng trong nghiên cứu là (NH4)2SO4, NH4NO3 và ure với tỷ lệ nitơ trong môi trường là tương đương nhau lấy muối (NH4)2SO4 4g/l làm chuẩn. Mẫu đối chứng không bổ sung nitơ. Hoạt tính enzym amylaza được xác định sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả được ghi ở hình 11.
Hình 11. Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới hoạt lực enzym amylaza
Kết quả ở hình 11 cho thấy: Nitơ có ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp của enzym của các chủng nghiên cứu. Đối với chủng kí hiệu BNM2, BGO4 và MHE6 mẫu bổ sung nitơ hoạt tính enzym amylaza tổng số, α- amylaza và glucoamylaza cao hơn mẫu đối chứng không bổ sung. Hai chủng kí hiệu BNM2 và BGO4 nguồn nitơ là NH4NO3 cho hoạt tính enzym cao nhất, trong khi chủng kí hiệu MHE6 mẫu sử dụng ure lại cho hoạt tính enzym cao nhất. Vì vậy, NH4NO3 nồng độ
BNM2 và BGO4. Nguồn ure nồng độ 1,8g/l được lựa chọn để bổ sung vào môi trường nuôi cấy chủng MHE6. Đối với chủng kí hiệu BNR2A thì việc bổ sung nitơ lại làm giảm hoạt lực enzym. Vì vậy, chủng kí hiệu BNR2A không cần bổ sung nguồn nitơ vào môi trường nuôi cấy.
3.3.4.3 Ảnh hưởng của nguồn photpho đến sinh trưởng và sinh tổng hợp amylaza
Hai nguồn photpho sử dụng trong nghiên cứu là KH2PO4 và K2HPO4 với tỷ lệ photpho trong môi trường là tương đương nhau, lấy muối KH2PO4 1g/l làm chuẩn. Mẫu đối chứng không bổ sung photpho. Hoạt tính enzym amylaza được xác định sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả được ghi ở hình 12.
Hình 12. Ảnh hưởng của nguồn photpho tới hoạt lực enzym amylaza
Kết quả ở hình 12 cho thấy: Nguồn photpho có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của tất cả 4 chủng nghiên cứu. Mẫu bổ sung photpho cho hoạt tính enzym cao hơn mẫu đối chứng không bổ sung. Với cùng hàm lượng photpho, mẫu sử dụng KH2PO4 (1g/l) cho hoạt lực enzym amylaza tổng số, α- amylaza và glucoamylaza cao hơn hẳn so với mẫu sử dụng K2HPO4 ở cả 4 mẫu thí nghiệm. Vì vậy, nguồn photpho KH2PO4 1g/l được lựa chọn để bổ sung vào môi trường nuôi cấy 4 chủng trên.
3.3.4.4 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợp amylaza
Thí nghiệm được tiến hành với pH môi trường thay đổi từ 4 – 6. Hoạt tính enzym amylaza tổng số, α- amylaza và glucoamylaza được xác định sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả được ghi ở hình 13.
Hình 13. Ảnh hưởng của pH tới sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym
Kết quả ở hình 13 cho thấy: Mỗi chủng khác nhau có pH thích hợp khác nhau. Dựa trên hoạt lực enzym tích tụ trong môi trường, chủng kí hiệu BNM2 và BNR2A hoạt tính enzym đạt cao nhất ở pH = 6, trong khi đó pH cho hoạt tính cao nhất của hai chủng kí hiệu BGO4 và MHE6 là pH = 5. Vì vậy, pH 6 được lựa chọn để nuôi cấy 2 chủng kí hiệu BNM2 và BNR2A và pH 5 được lựa chọn để nuôi cấy 2 chủng BGO4 và MHE6.
3.3.4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym amylaza
Để xác định nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của 4 chủng chọn lựa. 4 chủng kí hiệu BGO4; BNR2A; MHE6 và BNM2 được nuôi ở các nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C, 350C và 400C.
Hoạt tính enzym amylaza tổng số, α- amylaza và glucoamylaza được xác định sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả được ghi ở hình 14.
Hình 14. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym
Kết quả ở hình 14 cho thấy: Cả bốn chủng thử nghiệm đều có nhiệt độ sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym thích hợp nhất là 300C, ở nhiệt độ nuôi cấy 300C hoạt lực enzym đạt giá trị cao nhất. Vì vậy, nhiệt độ 300C được lựa chọn.
3.3.4.6 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến sinh trưởng và sinh tổng hợp amylaza
Đa số nấm mốc đều thích hợp ở điều kiện nóng và ẩm. Độ ẩm cũng là một yếu tố quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Chúng tôi đã tiến hành nuôi chúng trong các môi trường có độ ẩm khác nhau: 50%, 60%, 70% và 80%. Khả năng sinh tổng hợp enzym của các chủng nghiên cứu được xác định dựa trên kết quả phân tích hoạt lực enzym amylaza tổng số, α- amylaza và glucoamylaza. Kết quả được ghi ở hình 15.
Hình 15. Ảnh hưởng của độẩm tới sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym
Kết quả ở hình 15 cho thấy: Độ ẩm môi trường có ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym. Đối với chủng kí hiệu BNM2, BNR2A và MHE6 độ ẩm 60% là thích hợp nhất. Đối với chủng kí hiệu BGO4 độ ẩm thích hợp là 50%.
3.3.4.7 Ảnh hưởng của độ thoáng khí tới tới sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym
Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 250 ml có độ dày môi trường rắn thay đổi lần lượt là: 2 cm, 3 cm, 4 cm và 5 cm. Hoạt tính enzym amylaza tổng số, α- amylaza và glucoamylaza được xác định sau 48 giờ nuôi cấy. Kết quả được thể hiện ở hình 16.
Kết quả ở hình 16 cho thấy: Ở các độ thoáng khí khác nhau thì hoạt lực của enzym khác nhau. Đối với hai chủng kí hiệu BNM2 và BNR2A độ dầy môi trường 3cm là thích hợp nhất. Hai chủng còn lại BGO4 và MHE6 thì độ dầy môi trường 5cm cho hoạt tính enzym đường hóa cao nhất.
3.3.4.8 Ảnh hưởng của thời gian lên men tới quá trình sinh tổng hợp enzym
Để xác định thời gian ủ thích hợp, thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 250ml với các thời gian khác nhau thay đổi từ 1-3 ngày. Phân tích hoạt tính enzym amylaza tổng số, α- amylaza và glucoamylaza theo thời gian. Kết quả được ghi ở hình 17.
Hình 17. Ảnh hưởng của thời gian lên men tới hoạt lực enzym amylaza
Kết quả ở hình 17 cho thấy: Các chủng khác nhau có thời gian sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym tối thích khác nhau. Đối với chủng kí hiệu BNM2 thì hoạt tính enzym đạt cao nhất sau 2 ngày ủ. Ba chủng còn lại kí hiệu BNR2A; BGO4 và MHE6 thì hoạt tính enzym đạt cao nhất sau 3 ngày ủ.
Kết luận: Từ những kết quả nghiên cứu đã xác định được điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzym của 4 chủng lựa chọn như sau:
Kí hiệu chủng Điều kiện
BNM2 BNR2A BGO4 MHE6
Tỷ lệ cám: trấu: ngô 70% :20%: 10% 80% :10%: 10% 80% :20%: 0% 80% :10%: 10%
Nguồn nitơ NH4NO3 2,4g/l Không bổ sung NH4NO3 2,4g/l Ure 1,8g/l
Nguồn photpho KH2PO4 1g/l KH2PO4 1g/l KH2PO4 1g/l KH2PO4 1g/l
pH 6,0 6,0 5,0 5,0
Nhiệt độ (0C) 30 30 30 30
Độẩm (%) 60 60 50 60
Độ thoáng khí (g/∆250ml) 20g ~ 3,0cm 20g ~ 3,0cm 35g ~ 5,0cm 35g ~ 5,0cm
Thời gian nuôi (ngày) 2 3 3 3
3.4 Lựa chọn chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao 3.4.1 Chọn lọc chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao 3.4.1 Chọn lọc chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao
Với mục đích lựa chọn chủng nấm men có hoạt lực lên men cao, chịu được CO2, sinh axit bay hơi (axit axetic) thấp, hàm lượng các ester thơm cao (ethylaxetat, ethylhexanoat, isobutyl axetat, isoamyl axetat, n-hexyl axetat, ethyl butyrat v.v), hàm lượng các hợp chất cacbonyl thấp (axetaldehyt, axetoin, diaxetyl v.v), hàm lượng cồn bậc cao thấp (methanol, propanol, isobutanol, 2 phenylethanol v.v). Ba chủng nấm men trong sưu tập giống Vi sinh vật công nghiệp Thực phẩm kí hiệu BMQ 467; Y.7028; Y.7081 và chủng nấm men phân lập từ bánh men Mai Hạ kí hiệu BMH1 được đưa vào lên men trong môi trường cơm rượu. Phân tích chất lượng rượu sau lên men. Kết quả ghi ở bảng 12.
Bảng 12. Khả năng lên men cồn và chất lượng rượu sau lên men của bốn chủng nấm men nghiên cứu
TT
Chủng
Chỉ tiêu BMH6 BMQ467 Y.7081 Y.7028
1 Ethanol (0v/v) 6,1 6,1 6,1 6,5 2 Đường dư (g/l) 43,85 44,87 43,78 37,72 3 Methanol (g/l) 0,3117 0,0505 0,0170 0,0075 4 Acetaldehyde (g/l) 0,1577 0,1186 0,0941 0,4134 5 Acetone (g/l) 0,0017 0,0018 0,0014 0,0029 6 n- propanol (g/l) 0,0338 0,0352 0,0249 0,0319 7 Iso- butanol (g/l) 0,0497 0,0405 0,0318 0,0579 8 Ethylacetate (g/l) 0,0257 0,0191 0,0217 0,0470 9 Isoamylancol (g/l) 0,0657 0,0753 0,0468 0,0684 10 Furfurol (g/l) 0,0043 - - - 11 Ethylhexanoat (g/l) - - - -
Kết quả ở bảng 12 cho thấy trong 4 chủng nghiên cứu thì khả năng lên men của chủng Y.7028 là tốt nhất, độ cồn tạo thành cao nhất (đạt 6,5%v/v), hàm lượng đường dư và hàm lượng methanol thấp nhất. Đồng thời hàm lượng các hợp chất thơm như ethylacetate, isoamylancol gần như cao nhất. Vì vậy, chủng nấm men Y.7028 được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Xác định điều kiện phát triển tạo sinh khối của chủng chọn lựa 3.4.2.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm men thu sinh khối cao 3.4.2.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm men thu sinh khối cao
Sinh khối 24 giờ tuổi của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae Y7028 được tiếp vào hai môi trường nuôi cấy kí hiệu MT1 và MT2 với tỷ lệ bằng nhau và bằng 10%. Lên men ở 300C trong 24 giờ. Xác định lượng sinh khối thu được. Kết quả được thể hiện ở bảng 13.
Bảng 13. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng Y7028
Kí hiệu môi trường Lượng sinh khối thu được (g/100ml)
MT1 3,5 MT2 5 Kết quả ở bảng 13 cho thấy với cùng chủng giống và cùng tỷ lệ giống bổ sung, cùng điều kiện nuôi cấy, môi trường ký hiệu MT2 lượng sinh khối nấm men thu được nhiều hơn. Do vậy, môi trường MT2 được lựa chọn làm môi trường để tối ưu hóa các điều kiện lên men thu sinh khối chủng CNTP Y7028.
3.4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucoza đến sinh trưởng
Nồng độ đường glucoza trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành sinh khối nấm men, tuy nhiên sự dư thừa hàm lượng glucoza sẽ gây ra hiệu ứng Pasteur, nấm men sẽ chuyển từ trạng thái hô hấp sang trạng thái lên men, kết quả là lượng sinh khối tạo thành giảm xuống. Vì vậy, thí nghiệm được tiến hành với nồng độ glucoza thay đổi từ 20, 40, 60 và 80 g/l. Sinh khối 24 giờ tuổi của chủng Y.7028 được tiếp vào môi trường nuôi cấy với tỉ lệ 10%. Sau 24 giờ nuôi cấy lắc 150v/p, ở nhiệt độ 30ºC, dịch nuôi cấy được đem đi đo mật độ quang ở bước sóng 600nm để đánh giá khả năng tạo sinh khối của chủng nghiên cứu. Kết quả được thể hiện ở hình 18.
Kết quả ở hình 18 cho thấy: Lượng sinh khối thu được tăng tỷ lệ thuận với sự tăng nồng độ glucoza, với nồng độ glucoza 60g/l lượng sinh khối tạo thành đạt cao nhất (OD = 0,206). Khi nồng độ glucoza tăng tới 80g/l thì lượng sinh khối lại giảm xuống. Điều này có thể giải thích là khi nồng độ đường tăng cao thì xảy ra sự kiềm chế dị hóa, tại đó nấm men chuyển từ trạng thái hô hấp sang trạng thái lên men. Vì vậy, nồng độ glucoza 60g/l được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Ba nguồn nitơ là (NH4)2SO4, (NH2)2CO (Ure) và (NH4)2HPO4 với nồng độ nitơ bổ sung là như nhau. Mẫu đối chứng không bổ sung nitơ. Lên men ở 300C, lắc 150 v/p/24 giờ. Xác định sinh khối tạo thành dựa trên giá trị OD ở bước sóng 600nm và hàm lượng đường dư sau lên men. Kết quả được thể hiện ở hình 19.
Hình 19. Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sự sinh trưởng của chủng Y.7028
Kết quả ở hình 19 cho thấy: Mẫu có bổ sung nitơ có sinh khối cao hơn hẳn so với mẫu không bổ sung nitơ. Trong ba nguồn nitơ sử dụng, (NH4)2SO4 cho kết quả sinh khối cao nhất. Vì vậy, nguồn nitơ (NH4)2SO4 được lựa chọn.
Để tìm ra nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm men, môi trường nuôi cấy được bổ sung 60g/l glucoza, 5g/l cao nấm men, nồng độ (NH4)2SO4 thay đổi từ 1, 2, 3, 4 và 5 g/l, mẫu đối chứng không bổ sung (NH4)2SO4. Sau khi kết thúc lên men, dịch nuôi cấy được đem đi đo mật độ quang. Kết quả được thể hiện ở hình 20.
Hình 20. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4
Kết quả ở hình 20 cho thấy: Lượng sinh khối thu được tăng tỷ lệ thuận với sự tăng hàm lượng nitơ bổ sung. Tuy nhiên, khi nồng độ (NH4)2SO4 tăng trên 3g/l lượng sinh khối thu được không tăng. Vì vậy, nồng độ (NH4)2SO4 3g/l được lựa chọn.
3.4.2.4. Ảnh hưởng của photpho
Thí nghiệm được tiến hành với 2 nguồn photpho là KH2PO4 và K2HPO4.3H2O lấy nồng độ KH2PO4 5g/l làm chuẩn. Mẫu đối chứng không bổ sung photpho. Lên men lắc 150v/p; ở 300C trong 24 giờ. Sự sinh trưởng của giống được xác định dựa trên giá trị OD ở bước sóng 600nm và hàm lượng đường dư trong dịch sau lên men.Kết quả được thể hiện ở hình 21.
Kết quả hình 21 cho thấy: Với cùng chủng giống và cùng tỷ lệ giống bổ sung, cùng điều kiện thí nghiệm mẫu sử dụng K2HPO4.3H2O cho sinh khối cao nhất. Vì vậy, K2HPO4 được lựa chọn như nguồn cung cấp phospho để nuôi sinh khối chủng Y.7028. Để lựa chọn nồng độ K2HPO4 thích hợp, thí nghiệm được tiến hành với nồng độ K2HPO4 bổ sung thay đổi từ 0,2 -1g/l. Sau 24 giờ lên men ở 300C, lắc 150v/p, sự sinh trưởng của giống được xác định dựa trên giá trị OD ở 600nm và hàm lượng đường dư trong dịch sau lên men. Kết quả được thể hiện ở hình 22.
Hình 22. Ảnh hưởng của nồng độ K2HPO4 đến sinh trưởng của chủng Y.7028
Kết quả ở hình 5 cho thấy: Nồng độ K2HPO4 có ảnh hưởng đến sinh trưởng và tạo sinh khối của chủng Y.7028. Trong khoảng từ 0 – 0,6g/l, sinh khối tạo thành tăng tỷ lệ thuận với sự tăng nồng độ K2HPO4 bổ sung vào môi trường. Giá trị OD đạt cao nhất và lượng đường dư thấp nhất khi nồng độ K2HPO4 bổ sung là 0.6 g/l. Vì vậy, nồng độ K2HPO4 0.6g/l được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.5 Ảnh hưởng của magie (MgSO4.7H2O)
Magie có vai trò như một cofactor tham gia vào nhiều phản ứng enzim liên quan tới các quá trình phosphoryl hóa, do vậy, nó ảnh hưởng không nhỏ tới sinh trưởng của nấm men. Để nghiên cứu ảnh hưởng của magie, môi trường lên men thu sinh khối được bổ sung MgSO4.7H2O ở các nồng độ: 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 g/l. Mẫu đối chứng là môi trường không bổ sung magie. Lên men ở 300C, lắc 150vòng/phút trong 24 giờ. Xác định sự tạo thành sinh khối và đường dư. Kết quả được thể hiện ở hình 23.
* Độ pha loãng 150 lần.
Hình 23. Ảnh hưởng của MgSO4.7H2O đến sinh khối
Kết quả ở hình 23 cho thấy: MgSO4 có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp tế bào, giá trị OD ở các mẫu bổ sung MgSO4 cao hơn hẳn mẫu đối chứng không bổ