3.4.2.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm men thu sinh khối cao
Sinh khối 24 giờ tuổi của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae Y7028 được tiếp vào hai môi trường nuôi cấy kí hiệu MT1 và MT2 với tỷ lệ bằng nhau và bằng 10%. Lên men ở 300C trong 24 giờ. Xác định lượng sinh khối thu được. Kết quả được thể hiện ở bảng 13.
Bảng 13. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng Y7028
Kí hiệu môi trường Lượng sinh khối thu được (g/100ml)
MT1 3,5 MT2 5 Kết quả ở bảng 13 cho thấy với cùng chủng giống và cùng tỷ lệ giống bổ sung, cùng điều kiện nuôi cấy, môi trường ký hiệu MT2 lượng sinh khối nấm men thu được nhiều hơn. Do vậy, môi trường MT2 được lựa chọn làm môi trường để tối ưu hóa các điều kiện lên men thu sinh khối chủng CNTP Y7028.
3.4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucoza đến sinh trưởng
Nồng độ đường glucoza trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành sinh khối nấm men, tuy nhiên sự dư thừa hàm lượng glucoza sẽ gây ra hiệu ứng Pasteur, nấm men sẽ chuyển từ trạng thái hô hấp sang trạng thái lên men, kết quả là lượng sinh khối tạo thành giảm xuống. Vì vậy, thí nghiệm được tiến hành với nồng độ glucoza thay đổi từ 20, 40, 60 và 80 g/l. Sinh khối 24 giờ tuổi của chủng Y.7028 được tiếp vào môi trường nuôi cấy với tỉ lệ 10%. Sau 24 giờ nuôi cấy lắc 150v/p, ở nhiệt độ 30ºC, dịch nuôi cấy được đem đi đo mật độ quang ở bước sóng 600nm để đánh giá khả năng tạo sinh khối của chủng nghiên cứu. Kết quả được thể hiện ở hình 18.
Kết quả ở hình 18 cho thấy: Lượng sinh khối thu được tăng tỷ lệ thuận với sự tăng nồng độ glucoza, với nồng độ glucoza 60g/l lượng sinh khối tạo thành đạt cao nhất (OD = 0,206). Khi nồng độ glucoza tăng tới 80g/l thì lượng sinh khối lại giảm xuống. Điều này có thể giải thích là khi nồng độ đường tăng cao thì xảy ra sự kiềm chế dị hóa, tại đó nấm men chuyển từ trạng thái hô hấp sang trạng thái lên men. Vì vậy, nồng độ glucoza 60g/l được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Ba nguồn nitơ là (NH4)2SO4, (NH2)2CO (Ure) và (NH4)2HPO4 với nồng độ nitơ bổ sung là như nhau. Mẫu đối chứng không bổ sung nitơ. Lên men ở 300C, lắc 150 v/p/24 giờ. Xác định sinh khối tạo thành dựa trên giá trị OD ở bước sóng 600nm và hàm lượng đường dư sau lên men. Kết quả được thể hiện ở hình 19.
Hình 19. Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sự sinh trưởng của chủng Y.7028
Kết quả ở hình 19 cho thấy: Mẫu có bổ sung nitơ có sinh khối cao hơn hẳn so với mẫu không bổ sung nitơ. Trong ba nguồn nitơ sử dụng, (NH4)2SO4 cho kết quả sinh khối cao nhất. Vì vậy, nguồn nitơ (NH4)2SO4 được lựa chọn.
Để tìm ra nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm men, môi trường nuôi cấy được bổ sung 60g/l glucoza, 5g/l cao nấm men, nồng độ (NH4)2SO4 thay đổi từ 1, 2, 3, 4 và 5 g/l, mẫu đối chứng không bổ sung (NH4)2SO4. Sau khi kết thúc lên men, dịch nuôi cấy được đem đi đo mật độ quang. Kết quả được thể hiện ở hình 20.
Hình 20. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4
Kết quả ở hình 20 cho thấy: Lượng sinh khối thu được tăng tỷ lệ thuận với sự tăng hàm lượng nitơ bổ sung. Tuy nhiên, khi nồng độ (NH4)2SO4 tăng trên 3g/l lượng sinh khối thu được không tăng. Vì vậy, nồng độ (NH4)2SO4 3g/l được lựa chọn.
3.4.2.4. Ảnh hưởng của photpho
Thí nghiệm được tiến hành với 2 nguồn photpho là KH2PO4 và K2HPO4.3H2O lấy nồng độ KH2PO4 5g/l làm chuẩn. Mẫu đối chứng không bổ sung photpho. Lên men lắc 150v/p; ở 300C trong 24 giờ. Sự sinh trưởng của giống được xác định dựa trên giá trị OD ở bước sóng 600nm và hàm lượng đường dư trong dịch sau lên men.Kết quả được thể hiện ở hình 21.
Kết quả hình 21 cho thấy: Với cùng chủng giống và cùng tỷ lệ giống bổ sung, cùng điều kiện thí nghiệm mẫu sử dụng K2HPO4.3H2O cho sinh khối cao nhất. Vì vậy, K2HPO4 được lựa chọn như nguồn cung cấp phospho để nuôi sinh khối chủng Y.7028. Để lựa chọn nồng độ K2HPO4 thích hợp, thí nghiệm được tiến hành với nồng độ K2HPO4 bổ sung thay đổi từ 0,2 -1g/l. Sau 24 giờ lên men ở 300C, lắc 150v/p, sự sinh trưởng của giống được xác định dựa trên giá trị OD ở 600nm và hàm lượng đường dư trong dịch sau lên men. Kết quả được thể hiện ở hình 22.
Hình 22. Ảnh hưởng của nồng độ K2HPO4 đến sinh trưởng của chủng Y.7028
Kết quả ở hình 5 cho thấy: Nồng độ K2HPO4 có ảnh hưởng đến sinh trưởng và tạo sinh khối của chủng Y.7028. Trong khoảng từ 0 – 0,6g/l, sinh khối tạo thành tăng tỷ lệ thuận với sự tăng nồng độ K2HPO4 bổ sung vào môi trường. Giá trị OD đạt cao nhất và lượng đường dư thấp nhất khi nồng độ K2HPO4 bổ sung là 0.6 g/l. Vì vậy, nồng độ K2HPO4 0.6g/l được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.5 Ảnh hưởng của magie (MgSO4.7H2O)
Magie có vai trò như một cofactor tham gia vào nhiều phản ứng enzim liên quan tới các quá trình phosphoryl hóa, do vậy, nó ảnh hưởng không nhỏ tới sinh trưởng của nấm men. Để nghiên cứu ảnh hưởng của magie, môi trường lên men thu sinh khối được bổ sung MgSO4.7H2O ở các nồng độ: 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 g/l. Mẫu đối chứng là môi trường không bổ sung magie. Lên men ở 300C, lắc 150vòng/phút trong 24 giờ. Xác định sự tạo thành sinh khối và đường dư. Kết quả được thể hiện ở hình 23.
* Độ pha loãng 150 lần.
Hình 23. Ảnh hưởng của MgSO4.7H2O đến sinh khối
Kết quả ở hình 23 cho thấy: MgSO4 có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp tế bào, giá trị OD ở các mẫu bổ sung MgSO4 cao hơn hẳn mẫu đối chứng không bổ sung magie. Trong số 5 nồng độ MgSO4 thí nghiệm, nồng độ MgSO4 bổ sung 1 g/l cho kết quả cao nhất. Do đó, hàm lượng MgSO4 1 g/l được lựa chọn cho những thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.6 Ảnh hưởng của cao nấm men
Cao nấm men ngoài vai trò cung cấp nitơ hữu cơ còn là nguồn nhân tố sinh trưởng, đặc biệt là vitamin nhóm B. Để nghiên cứu ảnh hưởng của cao nấm men tới sinh trưởng của chủng nghiên cứu. Các nồng độ của chất này được bổ sung vào môi trường là 1; 2; 3; 4; 5 và 6 g/l, mẫu đối chứng không bổ sung cao nấm men;. Xác định lượng sinh khối tạo thành và hàm lượng đường dư trong dịch nuôi sau 24 giờ, lắc 200 vòng/phút ở 30oC. Kết quả thể hiện trong hình 24.
* Độ pha loãng 150 lần.
Kết quả ở hình 24 cho thấy, nồng độ cao nấm men có ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng của chủng CNTP 7028. Lượng sinh khối tạo thành tăng dần theo lượng cao nấm men bổ sung vào môi trường và đạt mức cao nhất ở nồng độ 5g/l. Tại nồng độ này, lượng đường dư cũng là thấp nhất. Do đó, nồng độ cao nấm men 5g/l được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.7 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng của chủng chọn lựa
Thí nghiệm được tiến hành với các tỷ lệ nitơ, magie, photpho và cao nấm men đã lựa chọn, ở nhiệt độ 30˚C trong 24 giờ ,với 3 tốc độ lắc khác nhau: 150; 200 và 250 vòng/phút. Mẫu đối chứng không lắc. Phân tích lượng sinh khối tạo thành và hàm lượng đường dư trong dịch sau lên men. Kết quả được thể hiện ở hình 25.
* Độ pha loãng 150 lần.
Hình 25. Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sự sinh trưởng của chủng Y.7028
Kết quả ở hình 25 cho thấy: Tốc độ lắc có ảnh hưởng khá nhiều đến sinh trưởng của chủng nghiên cứu. Tốc độ lắc càng lớn thì lượng sinh khối thu được càng tăng. Tại tốc độ lắc là 250 v/p cho lượng sinh khối lớn nhất, đường sót thấp nhất nên được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2.8 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình tạo sinh khối chủng chọn lựa kí hiệu Y.7028 lựa kí hiệu Y.7028
Chủng nấm men Y.7028 được nuôi cấy trên bình lên men Bioflo và thông khí trong suốt quá trình nuôi cấy. Kết quả được thể hiện ở hình 26.
* Độ pha loãng 100 lần
Hình 26. Động học của quá trình tạo sinh khối của chủng Y.7028
Kết quả ở hình 26 cho thấy khoảng thời gian nuôi cấy từ 0- 20 giờ, lượng sinh khối thu được tăng tỉ lệ nghịch với sự giảm hàm lượng đường trong môi trường. Ở thời điểm 20 giờ, tế bào nấm men sinh trưởng gần như cực đại, hàm lượng đường trong môi trường cũng gần như cạn kiệt. Sau 20 giờ nuôi cấy, lượng sinh khối thu được không những không tăng mà giảm chút ít. Như vậy, thời điểm 20 giờ được lựa chọn để thu hồi sinh khối chủng Y.7028.
Kết luận: Từ các kết quả thực nghiệm đã xác định được điều kiện để tạo sinh khối chủng nấm men Y 7028 tốt nhất như sau: Glucoza 60g/l; (NH4)2SO4 3g/l, K2HPO4 0,6g/l, MgSO4.7H2O 1 g/l, cao nấm men 5 g/l, pH 5,0, thông khí 1 vvm, nhiệt độ 30oC, thời gian lên men 20 giờ.
3.5 Nghiên cứu sản xuất bánh men theo phương pháp truyền thống kết hợp với việc bổ sung các vi sinh vật thuần chủng đã chọn lựa qui mô phòng thí nghiệm và việc bổ sung các vi sinh vật thuần chủng đã chọn lựa qui mô phòng thí nghiệm và qui mô gia đình
3.5.1 Nghiên cứu sản xuất bánh men qui mô phòng thí nghiệm 3.5.1.1 Xác định tỷ lệ nấm men, nấm mốc bổ sung 3.5.1.1 Xác định tỷ lệ nấm men, nấm mốc bổ sung
Chế phẩm nấm mốc và nấm men có được bổ sung vào bánh men với các tỷ lệ khác nhau. Nhận xét mẫu bánh men sau ủ và kiểm tra khả năng đường hóa và lên men rượu của bánh men sau khi sấy khô đến hàm ẩm 11-12%. Kết quả được ghi ở bảng 14
Bảng 14. Ảnh hưởng của tỷ lệ vi sinh vật đến quá trình đường hóa của bánh men TT Sach. (%) Mucor (%) Rhi. (%) Ory. (%) Nhận xét bánh men Đ tổng (g/l) EtOH %v/v Đg dư (g/l) Đường hóa cơm 1 0,5 0,5 0,5 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt mầu xám đen 72,63 6,0 0,72 Cơm mềm, nát, xẹp, ngọt, bề mặt hơi khô 2 1,0 0,5 0,5 0,5 Trắng, xốp nhẹ, bề mặt hơi nhăn 105,72 6,3 1,15 Cơm mềm, xẹp, hơi rời, ngọt, bề mặt hơi khô 3 1,5 0,5 0,5 0,5 Xốp nhẹ, trắng 1 vài chỗ có mầu xám, bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty 77,58 5,9 1,16 Cơm nát, xẹp, bề mặt khô, có ứa nước, ngọt 4 2,0 0,5 0,5 0,5 Xốp nhẹ, trắng 1 vài chỗ có mầu xám,
bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty 107,62 5,9 1,18 ứCa nơm nát, xước, ngẹọp, bt ề mặt khô, có 5 0,5 1,0 0,5 0,5 Xốp, nhẹ, nhăn, toàn bộ bề mặt phủ
lớp bào tử mầu xám đen 65,03 5,0 0,92 Cnhiơm xều bào tẹp, bửề mđen, bên dặt khô cứướng, i cơm mềm, ngọt nhẹ
6 0,5 1,5 0,5 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt phủ lớp khuẩn ty
với bào tử nâu nhạt 63,51 5,8 0,95 Ckhô, có ơm rất mứa nềm, nát, xước, ngọẹt p, bề mặt 7 0,5 2,0 0,5 0,5 Xốp nhẹ, trắng 1 vài chỗ có mầu xám,
bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty 155,91 5,9 1,29 Ckhô, ơm rứa ít nất ngọướt, nát, xc bên dẹp, bưới cề mốc ặt 8 0,5 0,5 1,0 0,5 Xốp nhẹ, men trắng 1 vài chỗ có mầu xám, bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty 77,58 6,1 1,00 Cơm hơi ngọt, nát, xẹp, bề mặt khô, 9 0,5 0,5 1,5 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt một vài chỗ có mầu xám đen 96,97 6,1 1,28 Ckhô, có ơm rất mứa nềm, nát, xước, ngọẹt p, bề mặt 10 0,5 0,5 2,0 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt chun gấp, nhiều
đám mầu xám đen hơn mẫu 8
79,10 6,0 0,98 Cơm rất mềm, nát, xẹp, bề mặt khô, có ứa nước, ngọt
11 0,5 0,5 0,5 1,0 Men xốp nhẹ, bề mặt có lớp khuẩn ty, mầu trắng.
71,11 5,9 0,92 Cơm không mềm, bề mặt khô, không ứa nước, có vị chua 12 0,5 0,5 0,5 1,5 Men xốp nhẹ, men trắng 1 vài chỗ có
mầu xám, bề mặt phủ lớp khuẩn ty
76,82 6,3 1,11 Cơm xẹp ít, bề mặt hơi khô, bên dưới ngọt có vị chua 13 0,5 0,5 0,5 2,0 Men xốp nhẹ, men trắng 1 vài chỗ có
mầu xám, bề mặt phủ lớp màng của khuẩn ty
91,65 6,3 1,46 Bề mặt cơm khô, có nhiều bào tử xanh, không ứa nước, không ngọt, có vị chua
14 1,0 1,0 0,5 0,5 Men xốp nhẹ, bề mặt chun gấp, một
vài chỗ có mầu xám đen 68,45 6,6 1,26 mCơặm rt không bất mềm, nát, xị khô, có ẹứp, ba ề nước, ngọt
15 0,5 0,5 1,0 1,0 Men xốp nhẹ, bề mặt có mầu xám đen 103,43 5,6 1,28 Cơm xẹp ít, bề mặt hơi khô, bên dưới cơm mềm, không ứa nước 16 0,5 1,0 1,0 0,5 Xốp nhẹ, phồng, bề mặt chun gấp, đám có mầu xám đen nhiều hơn mẫu 11 93,93 6,6 1,09 Cơm xẹp ít, bề mặt hơi khô, bên dưới cơm mềm, rất ngọt, có ứa nước 17 1,0 0,5 0,5 1,0 Xốp nhẹ, bề mặt hơi chun gấp, mầu trắng đẹp, 1 vài chỗ có mầu xám 97,73 6,6 1,44 Cơm xẹp ít, bề mặt khô, có bào tử xanh, bên dưới cơm không mềm, ngọt, có vị chua
18 1,0 1,0 1,0 1,0 Xốp nhẹ, bề mặt chun gấp, có đám
mầu đen, xám 79,10 6,7 1,46 Cbên dơm xướẹp ít, bi cơm không mề mặt hơi khô, ềm, ngọt, có vị chua
Kết quả ở bảng 14 và hình 27 cho thấy trong 18 mẫu thí nghiệm, mẫu số 14 với tỷ lệ Saccharomycopsis 1%, Mucor 1%, Rhizopus 0,5%, A.oryzae 0,5g%; và S. cerevisiae Y.7028 0,5% cho chất lượng bánh men tốt nhất. Bánh men trắng, hơi xám, xốp, thơm. Mẫu rượu lên men bằng bánh men số 14 cho độ rượu trong dấm chín khá cao (đạt 6,6%v/v) hàm lượng đường dư và axit tổng thấp. Vì vậy, tỷ lệ
Saccharomycopsis 1%, Mucor 1%, Rhizopus 0,5%, A.oryzae 0,5%; và S. cerevisiae
Y.7028 0,5%, được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.5.1.2 Xác định điều kiện ủ bánh men
a) Ảnh hưởng của hàm ẩm
Thí nghiệm được tiến hành với tỷ lệ Saccharomycopsis 1%, Mucor 1%,
Rhizopus 1%, A.oryzae 0,5% và S. cerevisiae Y.7028 0,5%, độ ẩm của bánh men thay đổi từ 50; 55 và 60%. Thời gian ủ 24 giờ ở 300C. Xác định số lượng tế bào vi sinh vật trong bánh men sau ủ. Kết quả được ghi ở bảng 15.
Bảng 15. Ảnh hưởng của độẩm đến số lượng vi sinh vật trong bánh men sau 48 giờ ủở 300C
Độ ẩm (%) Chủng vi sinh vật 50 55 60 Mucor (CFU/g) 1,2 x 103 2 x 104 1,3 x 105 Rhizopus (CFU/g) 1,5 x 103 3,5 x 104 3,2 x 105 A.oryzae (CFU/g) 2,5 x 104 1,5 x 103 1,1 x 102 Saccharomycopsis (CFU/g) 2,8 x 104 4,7 x 106 3,8 x 106 S.cerevisiae (CFU/g) 6,1 x 107 5,4 x 107 4,2 x 105
Kết quả ở bảng 15 cho thấy: Độ ẩm có ảnh hưởng đến sự phát triển của các chủng nấm mốc rất rõ rệt. Ba chủng Mucor, Rhizopus và Saccharomycopsis sinh trưởng tốt nhất khi hàm ẩm đạt 60% trong khi chủng A.oryzae sinh trưởng tốt với hàm ẩm là 50%. Tuy nhiên ở hàm ẩm 60% cả 4 chủng trên đều phát triển khá tốt. Vì vậy, hàm ẩm 60% được lựa chọn để trộn bánh men.
b) Ảnh hưởng của nhiệt độủ
Thí nghiệm được tiến hành với độ ẩm của bánh men 60%. Thời gian ủ 48 giờ, nhiệt độ ủ thay đổi lần lượt là: 300C, 320C và 350C. Sô lượng tế bào vi sinh vật trong