Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ
M pH 3,5 4,5 5,5
N Bx 20 22 24
Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-BehnkenSTT pH Bx Tỷ lệ nấm men (%) STT pH Bx Tỷ lệ nấm men (%) 1 3,5 20 10 2 3,5 24 10 3 3,5 22 5 4 3,5 22 15 5 4,5 20 5 6 4,5 20 15 7 4,5 22 10 8 4,5 22 10 9 4,5 22 10 10 4,5 24 5 11 4,5 24 15 12 5,5 20 10 13 5,5 24 10 14 5,5 22 5 15 5,5 22 15 Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 6. Nước dứa-sắn dây sau khi tìm được các điều kiện thích hợp về tỷ lệ phối chế cũng như khảo sát q trình ni cấy nấm men trong môi trường nước dứa-sắn dây, sẽ được tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men (pH, Brix, tỷ lệ nấm men) với các mức độ khảo sát được trình bày trong Bảng 3.7.
Thí nghiệm được tiến hành với 30 đơn vị thí nghiệm theo mơ hình Box – Behnken (Bảng 3.8).
Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng cồn sinh ra theo thời gian
Sự thay đổi tổng số tế bào nấm men trong dịch lên men Đánh giá cảm quan sản phẩm.
Đánh giá chất lượng sản phẩm nước uống lên men từ sắn dây và dứa
Xác định hàm lượng puerarin trong sản phẩm nước uống lên men. Phân tích các chỉ tiêu của sản phẩm nước uống lên men (theo TCVN). Đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm nước uống lên men.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thành phần hóa học của nguyên liệu sắn dây
Nguyên liệu sắn dây tươi sau khi mua về được gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng và sấy khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 70°C (Zhao et al., 2014). Sắn dây sau khi sấy khô được nghiền thành bột và tiến hành xác định các chỉ tiêu phân tích (Hình 4.1). Kết quả được thể hiện trong Bảng 4.1.
a b
c d
Hình 4.1: Nguyên liệu sắn dây
a-Nguyên liệu tươi; b-Sắn dây cắt lát; c-Sắn dây sau khi sấy khô; d-Sắn dây sau khi nghiền thành bột Bảng 4.1: Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản của bột sắn dây
STT Chỉ tiêu Phương pháp Kết quả
1 Độ ẩm AOAC 934.06 6,5%
2 Hàm lượng đường tổng TCVN 4594-88 10,77%
3 Hàm lượng tinh bột TCVN 4594-88 56,46%
4 Hàm lượng amylose TCVN 5716 30,19%
5 Hàm lượng amylopectin TCVN 5716 69,81%
Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy nguyên liệu sắn dây tươi mặc dù có độ ẩm tương đối cao (52,15%), tuy nhiên sau khi sấy khô và nghiền thành bột thì độ ẩm chỉ cịn lại 6,5%. Kết quả này có khác so với các nghiên cứu trước đây, độ ẩm bột sắn dây theo Nguyen Van Dao et al. (2009) là khoảng 5%, còn theo Wu et al. (2012) thì độ ẩm bột sắn dây thích hợp cho q trình trích ly isoflavone bằng phương pháp sóng siêu âm là 8,65%. Tùy theo mục đích của q trình sử dụng mà độ ẩm nguyên liệu ban đầu có khác nhau.
Tinh bột là thành phần chính trong sắn dây, theo báo cáo của Soni & Agarwal (1983) thì hàm lượng tinh bột trong củ tươi khoảng 15 ‒ 34,2%. Kết quả phân tích hàm
hàm lượng tinh bột của sắn dây Pueraria lobata được trồng tại tỉnh Thanh Hóa có hàm lượng tinh bột tổng 99,46% (Hung & Morita, 2007) và bột sắn dây được cung cấp bởi công ty Geye Starch (Anhui, China) 96,92% (Guo et al., 2016). Còn theo Xia et al. (2012), hàm lượng tinh bột tương ứng với hai loại sắn dây Pueraria lobata và Pueraria
thomsonii là 85,3 và 87,9%. Sự khác biệt này có thể giải thích là do thành phần hóa học và
cấu trúc tinh bột khác nhau tùy thuộc vào từng giống, điều kiện phát triển và phương pháp phân tích (Kirakosyan et al., 2003). Tinh bột được phân tách từ các loài sắn dây khác nhau sẽ thể hiện các tính chất khác nhau như tính chất lý hóa (hàm lượng amylose, khả năng trương nở, độ hịa tan,...), tính chất hình thái học, cấu trúc tinh thể, tính chất nhiệt (Du et al., 2002; Pham Van Hung & Morita, 2007). Thêm vào đó, Pham Van Hung
& Morita (2007) đã đưa ra kết luận cấu trúc tinh thể của 3 loại tinh bột sắn dây từ Việt Nam, Nhật Bản và Hàn Quốc có sự khác nhau là do mơi trường sinh trưởng khác nhau. Tuy nhiên, đây vẫn là nguyên liệu có hàm lượng tinh bột khá cao, thích hợp là cơ chất cho q trình thủy phân bằng enzyme để chuyển hóa tinh bột thành đường khử phục vụ các quá trình chế biến tiếp theo.
Thành phần chính của tinh bột là amylose và amylopectin. Kết quả từ Bảng 4.1 cho thấy hàm lượng amylose trong bột sắn dây khá cao (30,19%) khi so sánh với các loại tinh bột khác: khoai tây (21,01%), khoai lang (22,7%), củ sen (20,29%) (Guo et
al., 2016). Kết quả này cũng cao hơn nhiều so với bột sắn dây được cung cấp từ công
ty Geye, Trung Quốc (23,6%) (Guo et al., 2016) và sắn dây được trồng tại Thanh Hóa, Việt Nam (22,2%) (Pham Van Hung & Morita, 2007). Theo báo cáo của Suzuki et al. (1981), hàm lượng amylose trong bột sắn dây khoảng 20,8-21% trong khi đó, Soni & Agarwal (1983) đã chỉ ra rằng hàm lượng amylose trong bột sắn dây ít hơn 15,1%. Xia
et al. (2012) đã tiến hành xác định các đặc tính hóa lý, điểm kết tinh và tính chất nhiệt
của hai loài sắn dây Pueraria lobata (Willd.) Ohwi và Pueraria thomsonii Benth. Hàm lượng amylose trong hai loại sắn dây được xác định lần lượt là 20,1% và 24,7% tương ứng với các loài Pueraria lobata (Willd.) Ohwi và Pueraria thomsonii Benth. Reddy
et al. (2017) so sánh hàm lượng amylose trong các loại tinh bột bao gồm đậu đỏ và sắn
dây. Kết quả cho thấy hàm lượng amylose trong đậu đỏ là 19.18% trong khi đó hàm lượng tinh bột sắn dây là 23.34%. Liu et al. (2020) tiến hành so sánh cấu trúc và tính chất lý hóa của tinh bột từ đậu đỏ và đậu dolichos. Kết quả cho thấy đậu đỏ có hàm lượng amylose thấp hơn (26,64%) so với đậu dolichos (31,85%). Hàm lượng amylose trong bột sắn dây ở nghiên cứu này và các nghiên cứu khác có sự khác biệt là do đặc tính ngun liệu cũng như q trình chăm sóc và canh tác các loại cây trồng. Hung & Morita (2007) cũng đã chỉ ra rằng sự khác nhau của các kết quả về hàm lượng amylose có thể phụ thuộc vào giống cây trồng và điều kiện sinh trưởng của chúng.
Puerarin là hợp chất chiếm tỷ lệ cao nhất trong isoflavones của sắn dây bên cạnh daidzin, daidzein, genistin và genistein. Tuy nhiên, puerarin lại ít hịa tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ (ethanol, aceton), trong đó độ hịa tan của puerarin trong ethanol là cao nhất khi so sánh với nước và aceton (Wang & Cheng, 2005). Chính
vì thế để xác định hàm lượng puerarin trong nguyên liệu, ethanol được sử dụng làm dung mơi trích ly với sự hỗ trợ của sóng siêu âm theo phương pháp tối ưu của Wu et al. (2012).
Hình 4.2: Đồ thị đường chuẩn puerarin khi chạy HPLC
Đồ thị đường chuẩn sử dụng để định lượng puerarin được thể hiện trong Hình 4.2. Kết quả phân tích HPLC cho thấy hàm lượng puerarin có trong sắn dây (Pueraria
thomsonii) chiếm 0,96% (9,6 mg/g) (Hình 4.3). Kết quả này hồn tồn phù hợp với các tài
liệu ghi nhận được, hàm lượng puerarin trong Pueraria lobata không ít hơn 2,6% (HKCMMS, 2010), trong khi đó puerarin của Pueraria thomsonii nằm trong khoảng từ 0,3 đến 2,6% (PPRC, 2000, 2010). Theo Wong et al. (2015), khi so sánh hàm lượng puerarin có trong 2 lồi Pueraria lobata và Pueraria thomsonii, kết quả này một lần nữa khẳng định puerarin trong P. lobata (6,069%) cao hơn rất nhiều so với P. thomsonii (0,508%). Kết quả này cũng cao hơn khi so sánh với loài sắn dây Pueraria thomsonii nhưng được trích ly bằng methanol với sự hỗ trợ của vi sóng (0,586%) (Liu et al., 2011). Chen et al. (2016) tiến hành xác định thành phần hóa học của Pueraria thomsonii Benth khi sử dụng các phương pháp xử lý nhiệt khác nhau. Kết quả cho thấy hàm lượng flavonoid (mg CAE/g) trong sắn dây nguyên liệu trồng tại Trung Quốc được xác định là 0,3%. Điều này có thể được giải thích một phần bởi Aguilera et al. (2011) khi các tác giả
này cho rằng có sự phân giải các dẫn xuất isoflavone thành các dạng tự do khác nhau tùy theo các loài cây họ đậu và phương pháp chế biến nhiệt. Zhang et al. (2008) phát hiện ra rằng sắn dây từ các khu vực khác nhau của Trung Quốc có hàm lượng puerarin dao động từ 0,01 đến 1,00% (10 mg/g ở dạng thô). Kết quả hiện tại phù hợp với nghiên cứu trước đó, trong khi Zeng et al. (2012) cho rằng hàm lượng puerarin của sắn dây ăn được phát hiện là 4,07 mg/g khi sử dụng HPLC. Ngoài ra, nghiên cứu trên chỉ ra rằng quá trình luộc và hấp làm tăng hàm lượng isoflavone của sắn dây từ 0,77 mg/g (trong sắn dây thô) lên 2,12 mg/g (trong sắn dây luộc) và 1,03 mg/g (trong sắn dây hấp).
Hình 4.3: Bản sắc ký đồ phân tích puerarin bằng HPLC a. Puerarin trong mẫu chuẩn (thời gian lưu 3,2 phút), b. Puerarin trong nguyên liệu (thời gian lưu 3,22 phút)
4.2. Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng củaenzyme β-amylase enzyme β-amylase
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
Các mẫu bột sắn dây được chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau 8, 10, 12, 14 và 16%, được hồ hóa ở 90°C trong thời gian 30 phút, được hạ nhiệt xuống 60°C, bổ sung enzyme β-amylase ở nồng độ 20 U/g tinh bột và tiến hành thủy phân trong 2 giờ. Kết quả xác định hàm lượng đường khử được thể hiện trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hàm lượng đường khử
Mẫu Nồng độ cơ chất (%) Đường khử (mg/g)
1 8 119,56±6,4c 2 10 141,68±4,44d 3 12 116,99±7,86bc 4 14 108,04±3,98b 5 16 94,79±4,89a Tỷ số F 27,4 Giá trị P 0,0000
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%)
Kết quả Bảng 4.2 cho thấy khi nồng độ cơ chất tăng hàm lượng đường khử tạo ra trong dịch thủy phân cũng thay đổi. Hàm lượng đường khử tạo ra cao nhất (141,68 mg/g) ứng với nồng độ cơ chất 10% và thấp nhất (94,79 mg/g) ở nồng độ 16%. Các mẫu bột sắn dây ở các nồng độ 8, 10, 12 và 14% tạo ra lượng đường khử có sự khác biệt ý nghĩa so với mẫu ở nồng độ 16%. Khi nồng độ cơ chất tăng từ 8 lên 10%, hàm lượng đường khử tạo ra cũng tăng theo, tuy nhiên sau đó, hàm lượng đường khử tạo ra lại giảm xuống
khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất đến 16%. Siew Ling Hii et al. (2012) cho thấy quá trình thủy phân có thể thực hiện ở nồng độ cơ chất cao hơn (30 đến 40%) so với quy trình bình thường (25 đến 30%) nếu sử dụng sự kết hợp của enzyme khử phân nhánh và β-amylase. Mặt khác, Das & Kayastha (2018) sử dụng một loại enzyme β-amylase mới từ đậu phộng (Arachis hypogaea) để tiến hành thủy phân tinh bột. Kết quả cho thấy nồng độ cơ chất quá cao có thể ức chế một phần q trình thủy phân tinh bột do hiện tượng β-amylolysis (ức chế cơ chất) cùng với sự biến tính của enzyme do tiếp xúc lâu dài ở 50°C, trong giai đoạn sau của quá trình thủy phân. Tương tự với kết luận trên, Melnichuk et al. (2020) tiến hành thủy phân vỏ đậu nành và bột mì bằng phương pháp lên men sử dụng xúc tác là enzyme α-amylase từ nấm Aspergillus oryzae. Kết quả cho thấy khi sử dụng vỏ đậu nành/bột mì ở tỷ lệ là 9/11, hoạt tính xúc tác của enzyme đạt hiệu quả tốt nhất và không đổi khi tăng tỷ lệ cơ chất sử dụng. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme giảm được ghi nhận khi tăng nồng độ cơ chất sử dụng do hiện tượng ức chế cơ chất và mức độ hồ hóa của dung dịch hồ tinh bột lớn.
Nồng độ cơ chất là một trong những thông số quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng bởi enzyme. Ở mức nồng độ thấp (8%), hiệu suất thủy phân không cao dẫn đến hàm lượng đường khử tạo thành thấp. Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng tăng, kết quả hàm lượng đường khử của tinh bột sau thủy phân tăng. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng khơng tăng mà có chiều hướng giảm do hàm lượng chất khơ hịa tan cao làm tăng độ nhớt, ngăn cản enzyme tiếp xúc với cơ chất. Khi ứng dụng enzyme để cải thiện khả năng tiêu hóa chậm của tinh bột bắp, Miao et al., 2014 cũng chọn nồng độ tinh bột 10% để thực hiện q trình biến tính bằng enzyme β-amylase và BSMA. Có lẽ đây là nồng độ thích hợp cho việc thủy phân tinh bột bằng enzyme. Trên cơ sở đó, nồng độ cơ chất 10% được chọn làm thơng số cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.2. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tácdụng của enzyme β-amylase dụng của enzyme β-amylase
Enzyme chỉ có thể hoạt động tốt nhất ở trạng thái nhất định khi mà vận tốc xúc tác của phản ứng enzyme mạnh nhất. Trong quá trình thuỷ phân tinh bột, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào sự hình thành liên kết enzyme – tinh bột. Liên kết này do sự hấp thụ lẫn nhau giữa các nhóm háo nước có trên bề mặt của các hạt tinh bột và enzyme như [- COOH], [- OH], [- COO], [NH2], [- SH]. Các nhóm này khi tác dụng với nhau sẽ làm giảm năng lượng bề mặt, làm biến dạng các phần riêng biệt của phân tử amylose và amylopectin, dẫn đến làm đứt các liên kết glucoside để tạo sản phẩm và giải phóng enzyme. Trạng thái này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH môi trường, các ion kim loại, các hợp chất vô cơ và hữu cơ,… (Hoàng Kim Anh và ctv., 2003; Lê Ngọc Tú và ctv., 2002).
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng đường khử tạo thànhSTT pH Hàm lượng đường khử (mg/g) STT pH Hàm lượng đường khử (mg/g) 1 5 131,33±3,01b 2 5,5 149,24±5,88b 3 6 160,01±1,86c 4 6,5 137,74±5,81b 5 7 104,76±10,54a
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%)
Kết quả từ Bảng 4.3 cho thấy khi pH tăng thì hàm lượng đường khử tạo thành cũng tăng, trong đó mẫu ở pH 6 có hàm lượng đường khử cao nhất (160,01 mg/g). Kết quả thống kê cho thấy tất cả các mẫu đều có sự khác biệt ý nghĩa so với mẫu pH 6. Khi tiếp tục tăng giá trị pH đến 7 thì hàm lượng đường khử lại có chiều hướng giảm.
Khi điều chỉnh pH của dung dịch tinh bột ở khoảng pH trung tính (pH 7) thì có sự giảm hàm lượng đường khử tạo ra. Từ kết quả phân tích có thể thấy hoạt tính enzyme β-amylase thể hiện tốt nhất ở khoảng giá trị pH từ 5 đến 6 và đạt cao nhất ở pH 6. Có thể đây là giá trị pH thích hợp cho enzyme hoạt động.
pH trong mơi trường phản ứng có khả năng tác động lên trạng thái tích điện của nhóm carboxyl hoặc nhóm amin qua đó làm thay đổi các mối liên kết ion (vốn có chức năng tạo cấu hình khơng gian cho phân tử protein), chính vì vậy sẽ làm thay đổi cấu hình khơng gian của phân tử enzyme. Tại pH tối ưu, cấu hình khơng gian của enzyme hoặc trạng thái tích điện của cơ chất là phù hợp cho phản ứng xảy ra nhất. Ngoài pH tối ưu, khả năng xúc tác của enzyme yếu hơn hoặc bị bất hoạt (Lê Ngọc Tú và ctv., 1997; Hoàng Kim Anh và ctv., 2005; Shih et al., 2007). Theo kết quả phân tích, khi tăng giá trị pH hàm lượng đường khử tạo thành thay đổi không nhiều, kết quả thống kê cho thấy
ở nhiều mẫu sự khác biệt này là khơng đáng kể. Hay nói cách khác với khoảng pH từ 5-6,5 hoạt tính enzyme tương đối ổn định.
Kết quả này cũng gần tương đồng với kết quả của các nghiên cứu khác. Femi-Ola
et al. (2013) đã khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính β-amylase từ Bacillus subtilis với khoảng pH thay đổi từ 3 đến 8. Kết quả hoạt tính β-amylase cao nhất ở giá
trị pH 5. Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Federico Battista & David Bolzonella (2018) khi cho rằng hầu hết β-amylase đều có pH tối thích trong khoảng pH acid từ 4,5-6,2. Theo nghiên cứu của Obineme et al. (2003) thì pH tối thích cho β- amylase từ Aspergillus niger là 5, kết quả tương tự cho β-amylase từ Volvariella volvacea (Olaniyi et al., 2010). Sarowar et al. (2009) cho rằng pH tối thích cho β-
amylase từ rễ Raphanus sativus là 6. Sự khác nhau này có thể là do nguồn gốc của enzyme hay mỗi enzyme chỉ hoạt động tốt nhất ở một giá trị pH nhất định.