CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3. Tối ưu hóa quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của enzyme
4.3.1. Ảnh hưởng của pH đến quá trình biến tính hợp chất puerarin dưới tác dụng của
4.3.1. Ảnh hưởng của pH đến q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tácdụng của enzyme BSMA dụng của enzyme BSMA
Kết quả thống kê sự thay đổi hàm lượng puerarin dưới ảnh hưởng của pH được thể hiện trong Bảng 4.6.
Bảng 4.6: Sự thay đổi hàm lượng puerarin dưới ảnh hưởng của pH
STT pH Hàm lượng puerarin (mg/g) 1 4,5 6,84±0,22b 2 5 7,75±0,16c 3 5,5 7,10±0,22b 4 6 6,31±0,29a 5 6,5 6,31±0,27a
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%)
Kết quả thống kê cho thấy khi pH thay đổi từ 4,5 đến 6,5 thì hàm lượng puerarin tổng hợp được cũng thay đổi theo. Ở các giá trị pH 4,5; 5 và 5,5 hàm lượng puerarin tổng hợp được có khác biệt ý nghĩa so với pH 6 và 6,5, trong đó hàm lượng puerarin của mẫu ứng với giá trị pH 5 là cao nhất (7,75 mg/g) và khác biệt có ý nghĩa so với hàm lượng puerarin của các mẫu cịn lại. Kết quả này cho thấy hoạt tính của BSMA thể hiện rõ ở khoảng pH acid yếu (từ 4,5 đến 5,5) và cao nhất ở pH 5. Có thể đây là giá trị pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác của enzyme BSMA. Ở pH tối ưu, vận tốc phản ứng xảy ra nhanh nhất, BSMA thể hiện hoạt tính chuyển hóa tốt nhất.
Maltogenic amylase thể hiện tác động kép lên cơ chất, có khả năng cắt liên kết α- 1,4 và α-1,6 glycoside; chuyển liên kết α-1,4 thành α-1,6, α-1,3 hoặc α-1,4 khác. Hơn nữa, maltogenic amylase không chỉ cắt liên kết glycoside đầu tiên của phân tử acarbose mà còn chuyển acarviosine-glucose (sản phẩm thủy phân) đến các phân tử carbohydrate tiếp nhận (Sihui Pa et al., 2019). Bacillus stearothermophilus maltogenic α-amylase (BSMA) có tác dụng cắt chuỗi bên của amylopectin có thể kết tinh, do đó hạn chế sự tái kết tinh của amylopectin và sự hình thành mạng lưới trong quá trình bảo quản (Seung-Hye Woo et al, 2020). BSMA thủy phân cyclomaltoheptaose, pullulan, tinh bột, acarbose và thể hiện hoạt tính chuyển hóa, chuyển maltose và glucose đến phân tử chất nhận bằng cách tạo liên kết α-(1,4) và α-(1,6)-glycoside (Baek et al., 2003). Cụ thể trong nghiên cứu này, BSMA chuyển các gốc đường glucose, maltose đến phân tử chất nhận (puerarin) để tạo thành các sản phẩm chuyển hóa của puerarin, qua đó làm tăng độ hịa tan của puerarin. Ngồi giá trị pH tối ưu thì hoạt tính của enzyme giảm, kết quả dẫn tới hàm lượng puerarin tổng hợp được cũng giảm theo.
pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme. pH trong mơi trường phản ứng có khả năng tác động lên trạng thái tích điện của nhóm carboxyl hoặc nhóm amin qua đó làm thay đổi các mối liên kết ion (vốn có chức năng tạo cấu hình 3D
enzyme (Hình 4.7). Độ pH ban đầu làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Tại pH tối ưu, cấu hình khơng gian của enzyme hoặc trạng thái tích điện của cơ chất là phù hợp cho phản ứng xảy ra nhất. Ngồi pH tối ưu thì khả năng xúc tác của enzyme yếu hơn hoặc bị bất hoạt (Lê Ngọc Tú và ctv., 2002;
Hoàng Kim Anh và ctv., 2005; Shih et al., 2007). pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ảnh hưởng đến điện tích cũng như khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, làm giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme. Do đó, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm hoặc bị mất (Zhiwen Cao et al. 2019).
Hình 4.7: Cấu trúc 3D của phân tử protein (Nguồn: Marks et al., 2011)
Nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp amylase của vi sinh vật và có những cơng bố rất khác nhau. Prajapati (2014) đã công bố pH tối ưu để B.amyloliquefaciens KCP2 sinh tổng hợp amylase cao là 8,0. Trong khi đó, kết quả từ nghiên cứu của Nguyễn Thế Trang và ctv., (2012) cho thấy, chủng Geobacillus sp. LP09 có hoạt tính α-amylase tốt nhất trong khoảng pH từ 6,5 ‒ 7,5. Ở pH 7 hoạt tính α-amylase cao nhất đạt 14,6 UI/mL. Ở pH 6 hoạt tính α-amylase thấp nhất chỉ đạt 13,2 UI/mL, trong khi đó ở pH 8 hoạt tính chỉ đạt 13,6 UI/mL.
Từ các phân tích trên, giá trị pH 5 được chọn là thơng số thích hợp cho q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tác dụng của enzyme BSMA.
4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA đến q trình biến tính hợp chất puerarin
Tối ưu hóa q trình biến tính hợp chất puerarin được thực hiện bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, các nghiệm thức được bố trí theo mơ hình Box-Behnken. Ba yếu tố được lựa chọn cho quá trình là nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA. Hàm lượng puerarin tổng hợp được sau q trình biến tính được dùng để đánh giá hiệu quả của q trình chuyển hóa (Hình 4.8).
pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 6,5 pH 7
Hình 4.8: Dịch sắn dây sau khi ủ enzyme và lọc
Kết quả hàm lượng puerarin tính tốn theo mơ hình và hàm lượng đo cụ thể được thể hiện ở Bảng 4.7. Bảng 4.8 trình bày kết quả phân tích thống kê ANOVA cho việc tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của enzyme BSMA.
Bảng 4.7: Sự thay đổi hàm lượng puerarin (mg/g) dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA
Nhiệt độ Thời gian Nồng độ (U/g Hàm lượng puerarin Hàm lượng
STT puerarin (theo
(oC) (giờ) tinh bột) (theo thực nghiệm) mơ hình)
1 45 2 15 7,1067±0,0167 7,1122 2 45 6 15 7,1184±0,0340 7,1253 3 45 4 10 7,1192±0,0198 7,0855 4 45 4 20 7,1241±0,0257 7,1452 5 65 2 15 7,2483±0,0250 7,2242 6 65 6 15 7,2258±0,0308 7,2373 7 65 4 10 7,1829±0,0249 7,1975 8 65 4 20 7,2592±0,0042 7,2572 9 55 2 10 7,1004±0,0685 7,1191 10 55 2 20 7,0563±0,0192 7,0560 11 55 6 10 7,0091±0,0333 7,0094 12 55 6 20 7,2107±0,0562 7,1919 13 55 4 15 7,4782±0,0119 7,4840 14 55 4 15 7,4976±0,0433 7,4840 15 55 4 15 7,4762±0,0265 7,4840
*: giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm
Việc thăm dị và tối ưu hóa một bề mặt đáp ứng có thể tạo ra những kết quả không mong muốn, trừ khi mơ hình đó thể hiện sự phù hợp tốt thơng qua việc kiểm định sự phù hợp của mơ hình (Liyana-Pathirana et al., 2005). Hệ số R2 được dùng để kiểm định mức độ phù hợp của mơ hình (Nath et al., 2007) và giá trị này lớn hơn 0,90 thể hiện mức độ phù hợp cao (Haaland et al., 1989). Giá trị R2 nhỏ thể hiện sự tương tác kém của các biến phụ thuộc trong mơ hình.
Bảng 4.8: Kết quả phân tích thống kê ANOVA cho hàm lượng puerarin
Mã hóa Tổng bình Độ tự do Trung bình Giá trị F Giá trị p
phương bình phương
Model 1,01646 9 0,11294 90,54 0,0000
X4: nhiệt độ (0C) 0,075208 1 0,075208 82,90 0,0001
X5: thời gian (giờ) 0,00102704 1 0,00102704 1,13 0,3283
X6: nồng độ enzyme 0,0213786 1 0,0213786 23,56 0,0028 (U/g) X4X4 0,149055 1 0,149055 164,29 0,0000 X4X5 0,000873813 1 0,000873813 0,96 0,3643 X4X6 0,00382704 1 0,00382704 4,22 0,0858 X5X5 0,413573 1 0,413573 455,85 0,0000 X5X6 0,0452395 1 0,0452395 49,86 0,0004 X6X6 0,428437 1 0,428437 472,23 0,0000 Block 0,00147624 2 0,000738121 0,81 0,4868 Residual 0,0436594 35 0,00124741 Lack-of-fit 0,0367397 27 0,00136073 1,50 0,3230 Pure error 0,00544353 6 0,000907254 Total (corr.) 1,06012 44 R2 0,9602 Adj R2 0,9499
Kết quả phân tích thống kê ANOVA (Bảng 4.8) cho thấy mơ hình tương quan có ý nghĩa thống kê cao, giá trị cho hệ số R2 bằng 0,96. Ý nghĩa của mỗi hệ số được xác định thông qua kiểm định F và giá trị p. Kết quả Bảng 4.8 đã cho thấy giá trị F và p của mơ hình lần lượt là 90,54 và 0,00; điều đó có nghĩa là mơ hình đã được chấp nhận. Từ các số liệu thu thập được, mơ hình tương quan giữa hàm lượng puerarin tổng hợp được từ q trình chuyển hóa giữa các gốc đường maltose, glucose và phân tử puerarin và các nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian, nồng độ) đã được xây dựng và thể hiện ở phương trình 4. Z = 1,59074 + 0,129549X4 + 0,32109X5 + 0,197767X6 – 0,00116001X42 – 0,000426667X4X5 + 0,000357167X4X6 – 0,0483066X52 + 0,00614X5X6 – 0,00786672X62 (4) Trong đó: Z: puerarin (mg/g)
Các hệ số trong mơ hình bao gồm hệ số bậc một, hệ số bậc hai, hệ số tương tác đều có ý nghĩa (p<0,05), trong đó các hệ số khơng có ý nghĩa có thể được lược bỏ nhằm rút gọn phương trình. Phương trình (4) trở thành: Z = 1,38994 + 0,133199X4 + 0,217411X6 + 0,297624X5 – 0,00116001X42 – 0,00786672X62 – 0,0483066X52 + 0,00614X5X6 (5)
Trong mơ hình này các hệ số tương tác giữa nhiệt độ-thời gian, nhiệt độ-nồng độ đã được lược bỏ. Hệ số tuyến tính thời gian (p = 0,32>0,05) tuy khơng có ý nghĩa nhưng vẫn được giữ trong mơ hình nhằm đảm bào tính hệ thống của mơ hình. Bên cạnh đó,
kiểm tra độ phù hợp của mơ hình thơng qua kiểm tra Lack of fit (p = 0,32) khơng có ý nghĩa thống kê càng khẳng định khả năng phù hợp của mơ hình là rất cao.
Phương trình (6) được thiết lập để diễn tả sự tương thích giữa hàm lượng puerarin tổng hợp được theo thực nghiệm và hàm lượng puerarin theo mơ hình. Hệ số R2 bằng 0,9895 càng khẳng định dữ liệu dự đốn theo mơ hình và thực nghiệm có độ tương thích cao.
y = 0,9895 x + 0,0756 (6)
Hình 4.9: Biểu đồ thể hiện sự tương thích giữa hàm lượng puerarin theo thực nghiệm và theo mơ hình
Hình 4.10: Đồ thị sắc ký phân tích hàm lượng puerarin. (A) puerarin chuẩn (thời gian lưu 3,22 phút), (B) puerarin trong dịch thủy phân (thời gian lưu 3,23 phút)
Phân tích HPLC để xác định hàm lượng puerarin tổng hợp được với thời gian lưu của peurarin chuẩn và puerarin trong mẫu tương ứng được xác định là 3,22 phút và 3,23 phút.
(A)
(B)
(C)
Hình 4.11: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng của một số yếu tố đến q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tác dụng của enzyme BSMA (mg/g)
A: ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ (ở nồng độ 15U/g bột) B: ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ (ở thời gian 4 giờ) C: ảnh hưởng của thời gian và nồng độ (ở nhiệt độ 55oC)
Để xem xét sự tương tác của các nhân tố ảnh hưởng, các đồ thị 3 chiều của mơ hình hồi quy khơng tuyến tính được trình bày ở Hình 4.11. Hình biểu diễn cho thấy cả
3 nhân tố (nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzyme) cũng như sự tương tác của các cặp nhân tố (nhiệt độ-thời gian, thời gian-nồng độ, nhiệt độ-nồng độ) đều có ảnh hưởng đến hàm lượng puerarin tổng hợp được. Khi nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme tăng từ 45oC,
2 giờ và 10 U/g bột, tương ứng, đến giá trị tối ưu, thì hàm lượng puerarin tổng hợp được cũng tăng theo. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng ngoài giá trị tối ưu thì puerarin lại có chiều hướng giảm.
Các phản ứng chuyển hóa được biết đến để biến đổi một số đặc tính của các chất như glycoside. Có rất nhiều sản phẩm chuyển hóa được tạo thành giữa chất cho và nhiều loại chất nhận khác nhau bằng việc sử dụng enzyme riêng biệt để thực hiện các phản ứng chuyển hóa. Tính đặc hiệu của q trình chuyển hóa phụ thuộc vào loại enzyme, cấu hình của liên kết glycoside được tạo thành giữa phân tử chất cho và chất nhận (Park et al., 2012). Các phương pháp chuyển hóa dùng enzyme có nhiều thuận lợi hơn so với phương pháp hóa học trong việc tổng hợp các oligosaccharides và dẫn xuất của chúng như các bước phản ứng ít hơn, quy trình tinh chế đơn giản hơn và năng suất cao hơn (Park et al., 2012). Enzyme BSMA không những chuyển các mono và disaccharides mà cịn có khả năng chuyển nhiều hợp chất có cấu trúc khác nhau như hợp chất đường rượu, flavonoids (Lee et al., 1999) và acid ascorbic (Bae et al., 2002). Nhiều phân tử sinh học quan trọng có thể bị biến tính bằng phản ứng chuyển hóa dẫn đến các tính chất của chúng cũng thay đổi theo (Lee et al., 1999; Cho et al., 2000 ; Meulenbeld & Hartmans, 2000; Bae et al., 2002; Baek et al., 2003).
Cơ chế phản ứng của enzyme BSMA được Homa Torabizadeh & Ensieh Montazeri (2020) trình bày như sau: enzyme maltogenic amylase có khả năng cắt các liên kết trong phân tử amylose và amylopectin. Đối với amylose, BSMA có tác dụng cắt liên kết α-1,4 hiệu quả tạo thành các mạch oligosaccharide ngắn hơn bao gồm từ 2 đến 10 phân tử đường đơn liên kết với nhau. Đối với amylopectin, BSMA có tác dụng cắt liên kết α-1,4 tốt hơn so với liên kết α-1,6 tạo thành sản phẩm là các bó amylopectin có độ phân nhánh cao. Vì vậy, với nồng độ cơ chất sử dụng thấp, quá trình thủy phân tạo thành sản phẩm là các phân tử maltose vì vậy enzyme này có tên là “maltogenic amylase”. So sánh với CGTases hoạt tính chuyển glycoside của maltogenic amylase yếu hơn nhiều bởi vì maltogenic amylase chủ yếu chuyển cơ chất thành các sản phẩm thủy phân.
Choi et al., 2010 đã ứng dụng hoạt tính chuyển hóa của BSMA để cải thiện độ hòa tan của puerarin với cơ chất sử dụng là maltodextrin. Kết quả phản ứng chuyển hóa puerarin sử dụng BSMA thơ tạo ra sản phẩm với tỷ lệ lượng tương đối của các chất maltosyl-α-(1-6)-puerarin, glucosyl-α-(1-6)-puerarin, glucosyl-α-(1-3)-puerarin và puerarin được xác định tương ứng là 26:18:7:49. Trải qua quá trình tinh sạch 2 bước, thu được 1,7 g các sản phẩm chuyển hóa của puerarin từ 3 g puerarin. Park et al. (2012) cũng đã nghiên cứu quá trình biến đổi sinh học của hợp chất isoflavone bằng hoạt tính chuyển hóa của enzyme MAase. Các MAase khơng chỉ xúc tác quá trình thủy phân cơ chất mà
tạo thành liên kết α-(1,6)-glycoside. Hai sản phẩm chính của q trình chuyển hóa lần lượt là các chất glucosyl-α-(1,6)-puerarin và maltosyl-α-(1,6)-puerarin. Sử dụng enzyme chuyển hóa BSMA khơng những cải thiện độ hịa tan trong nước của puerarin mà cịn duy trì đầy đủ hoạt tính chống oxy hóa và hạ cholesterol máu của puerarin (Li
et al., 2004; Chung et al., 2008).
Kết quả phân tích cho thấy ở nhiệt độ 55°C, thời gian 4 giờ và nồng độ enzyme BSMA 15 U/g bột, hàm lượng puerarin tổng hợp được là cao nhất (dao động từ 7,4762 mg/g đến 7,4976 mg/g). Từ kết quả thu được từ mơ hình, điều kiện tối ưu của quá trình chuyển hóa cũng đã được xác lập như sau: nhiệt độ 57,48°C, thời gian 4,05 giờ và nồng độ enzyme 15,46 U/g tinh bột. Khi tiến hành thủy phân bột sắn dây với điều kiện tối ưu dưới tác dụng của enzyme β-amylase và BSMA, hàm lượng puerarin tổng hợp được là 7,51±0,02 mg/g, kết quả này khơng khác biệt có ý nghĩa so với kết quả dự đốn từ mơ hình (7,49 mg/g) ở độ tin cậy 95%.
Phương pháp bề mặt đáp ứng theo mơ hình Box-Behnken được áp dụng để tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây cũng như quá trình biến tính hợp chất puerarin để cải thiện độ hịa tan trong nước của puerarin. Quá trình thủy phân bột sắn dây dưới tác dụng của β-amylase ở điều kiện tối ưu 54,34oC, nồng độ enzyme 41,46 U/g bột với thời gian 4,24 giờ thì hàm lượng đường khử thu được là cao nhất 161,07±2,96 mg/g. Hàm lượng puerarin tổng hợp được khi phân tích sắc ký lỏng cao áp là 7,5085±0,02 mg/g ở điều kiện tối ưu như sau: 57,47 oC; 4,05 giờ; BSMA 15,45 U/g bột.
4.4. Quy trình biến tính hợp chất puerarin đề nghị
Chuẩn bị nguyên liệu
Hoạt độ
pH (Thông tin xử lý)
Hình 4.12: Quy trình biến tính hợp chất puerarin đề nghị
Thuyết minh quy trình
Sắn dây tươi sau khi mua về được gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng, sấy khô đến khối lượng không đổi ở 70°C.
Nghiền: sắn dây sau khi sấy khô được đem đi nghiền mịn, bảo quản trong tủ mát và được sử dụng xuyên suốt trong q trình thí nghiệm. Q trình nghiền nhằm mục đích đồng nhất ngun liệu, tạo điều thuận lợi cho các công đoạn tiếp theo.
Hồ hóa: nhằm phá vỡ màng tế bào của tinh bột sắn dây, giúp cho tinh bột hòa tan trong nước dễ dàng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân. Q trình hồ hóa được thực hiện ở nồng độ cơ chất 10%, nhiệt độ 90°C trong thời gian 30 phút.
Đường hóa: nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho q trình chuyển hóa tinh bột thành đường (maltose và các dextrin). Giai đoạn này được thực hiện dưới tác dụng của enzyme β-amylase. Các điều kiện tối ưu về nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme tương ứng: 54,34°C, 4,24 giờ, 41,46 U/g bột sắn dây.
Xử lý BSMA: dung dịch sắn dây trong giai đoạn đường hóa sẽ tạo ra đường maltose và các dextrin. Vì vậy, việc bổ sung enzyme BSMA trong giai đoạn này nhằm thủy phân các đường trên thành các đường glucose, maltose đồng thời gắn các gốc