CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG
3.3. Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng
3.3.3. Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men
lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh bacteriocin:
28
Môi trường lỏng của LB được bổ sung các muối: KCl, ZnSO4, MnSO4,
CuSO4, MgCl2, CaCl2, NaNO3, NaHCO3, mỗi loại 1 mM được bổ sung vào môi
trường riêng rẽ hoặc tổ hợp.
Môi trường sau khi được chuẩn bị được khử trùng ở 121°C trong 20 phút và để nguội trước khi sử dụng. Quá trình lên men được thực hiện tại các giá trị:
tốc độ khuấy 180 vòng/phút; pH 7; nhiệt độ lên men 37oC; mật độ giống 107
CFU/ml; thời gian lên men 48 giờ.
Các vùng ức chế xung quanh giếng được kiểm tra để xác định hoạt tính
kháng khuẩn của bacteriocin được biểu thị bằng đơn vị (AU: arbitrary units) trên mỗi ml.
Theo cách tính: (AU /ml = 2n *1000/V); trong đó (V thể tích mẫu µl cho vào giếng trên đĩa thạch); n là hệ số pha loãng lớn nhất vẫn cho hoạt tính ức chế.
- Nghiên cứu điều kiện lên men cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin
Các nghiên cứu được thực hiện tại những điều kiện lên men theo cách thay
đổi yếu tố theo dõi và giữ nguyên các yếu tố còn lại (theo các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường lên men đã thực hiện):
+ Tốc độ khuấy (vòng/phút): 140, 150, …210, 220, bước nhảy 10 vịng/phút;
+ pH mơi trường: 4-10, bước nhảy 1;
+ Nhiệt độ lên men (oC): 31, 33, … 45, bước nhảy 2oC; + Mật độ giống (CFU/ml): 106, 107, 108;
+ Thời gian lên men (giờ): 24, 48, 72, 96.
3.3.4. Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin qui mơ phịng thí nghiệm.
Dung môi hữu cơ, etyl axetat, n-butanol, n-hexan, diclometan, triclometan, được trộn riêng rẽ với với phần dịch nổi lên men theo tỷ lệ như nhau (1/1), và lắc 200
vịng/phút trong trong 2 giờ. Pha chứa dung mơi được tách, sau đó dung mơi hữu cơ
được loại bỏ bằng cô quay hút chân không để thu cặn ở 55oC. Phần cặn của dịch chiết dung môi được hồn ngun với 1/100 thể tích dung dịch PBS đến pH 7.
29
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và protease đến hoạt tính của
bacteriocin
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ: Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt
tính của bacteriocin, dịch nổi lên men chủng vi khuẩn được ủ tại các nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 40 - 100°C (bước nhảy là 5oC), ủ trong 30 phút. Hoạt tính bacteriocin còn lại được xác định bởi phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
+ Ảnh hưởng của pH: Ảnh hưởng của pH lên bacteriocin được xác định
bằng cách điều chỉnh giá trị pH của dịch nổi sau lên men của vi khuẩn bởi HCl và NaOH 1N từ 3 - 12 (bước nhảy là 1 đơn vị pH) và ủ trong 2 giờ ở 37°C. Tất cả các mẫu sau đó được điều chỉnh lại đạt giá trị pH ban đầu trước khi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn.
+ Ảnh hưởng của enzyme: dịch nổi sau lên men được xử lý trong 2 giờ
với enzyme lysozyme, protease K, tripsin, Amylase tại nồng độ cuối là 1mg/ml. Hoạt tính bacteriocin cịn lại kháng các chủng vi khuẩn kiểm định được phân tích bởi phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Dịch lên men không bị xử lý bởi
enzyme được sử dụng như đối chứng.
3.3.5. Phương pháp đo OD để đánh giá mật độ tế bào vi sinh vật
Nguуên lý đo mật độ quang (optical density - OD) : Dựa trên nguуên lý của
hiện tượng quang phổ hấp thụ. Quang phổ hấp thụ thực chất là quá trình tương tác giữa hạt photon của ánh ѕáng ᴠới các phần ᴠật chất. Khi ta chiếu một chùm tia
ѕáng gồm các photon có các mức năng lượng khác nhau đi qua một dung dịch chất
hấp thụ. Dung dịch chỉ hấp thụ chọn lọc những photon nào có mức năng lượng phù hợp ᴠới các mức năng lượng điện tử, năng lượng dao động ᴠà năng lượng quaу của phân tử chất đó.
Như ᴠậу các phân tử ᴠật chất có cấu trúc khác nhau ѕẽ cho những phổ hấp
thụ ᴠới các đỉnh ᴠà bước ѕóng đặc trưng khác nhau. OD sau nuôi cấy vi khuẩn được đo ở bước sóng 600 nm.
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
30
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tại vùng biển Nam Định bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tại vùng biển Nam Định
Mẫu tôm được thu thập tại khu vực cập cảng đánh bắt cá của huyện Giao thủy, huyện Hải Hậu tỉnh Nam Định và các ao nuôi được xử lý bề mặt và thu thập mẫu nội tạng để phân lập vi sinh vật. Từ 10 mẫu tôm được thu thập để nghiên cứu. Các mẫu ruột tôm được nghiền mịn, sau đó pha lỗng đến 10-4 trong nước muối sinh lý, dịch sau pha lỗng (100 µl) được cấy trải trên đĩa môi trường LB, ủ ở 37oC trong 36 giờ. Sau thời gian ủ, các khuẩn lạc (vi khuẩn, Bacillus) được quan sát và
đếm số lượng. Mật độ vi sinh vật được tổng hợp trong bảng 4.1
Bảng 4.1. Mật độ vi sinh vật từ ruột các mẫu tơm nước mặn
TT Kí hiệu Nguồn PL Vi khuẩn tổng
số (cfu/g)
Bacillus
(cfu/g)
1 TO-N1 Ao nuôi tôm nước mặn, Hải
Hậu, Nam Định 2.0E+06 4.0E+04 2 TO-N2 Ao nuôi tôm nước mặn, Hải
Hậu, Nam Định 2.3E+06 1.30E+04 3 TO-N3 Ao nuôi tôm nước mặn, Hải
Hậu, Nam Định 7.30E+04 2.00E+03 4 TO-BN1 Biển, Hải Hậu, Nam Định 1.14E+06 2.5E+04 5 TO-BN2 Biển, Hải Hậu, Nam Định 1.32E+06 2.0E+04 6 TO-BN3 Biển, Hải Hậu, Nam Định 1.03E+06 3.0E+03 7 TO-BN4 Biển, Hải Hậu, Nam Định 1.05E+06 1.0E+03 8 TO-BT1 Biển, Hải Hậu, Nam Định 4.6E+06 2.0E+05 9 TO-BT2 Biển, Hải Hậu, Nam Định 5.8E+04 3.0E+03 10 TO-BT3 Biển, Hải Hậu, Nam Định 1.06E+05 1.1E+05
31
Từ 10 mẫu ruột tôm đã tiến hành phân lập 50 khuẩn lạc đặc trưng, thuần khiết. Các khuẩn lạc được nuôi cấy riêng rẽ trong bình tam giác 50 mL chứa 30
ml mơi trường LB, ở 37oC, ni lắc 180 vịng/phút sau 48 giờ. Dịch ni được li tâm ở 6000 vịng/phút, trong 15 phút. Dịch nổi của mỗi khuẩn lạc được thử hoạt
tính enzyme amylase, cellulase, protease trên đĩa thạch chứa cơ chất tương ứng. Đồng thời dịch nổi cũng được nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn kiểm định trên đĩa thạch.
Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào amylase, cellulase, protease của 50 chủng vi sinh vật được trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các chủng phân lập từ ruột tơm.
Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng phân lập TT Tên kí hiệu Amylase (mm) Cellulase (mm) Protease (mm)
1 TO-N1.1 28 18 21 2 TO-N1.2 - 13 20 3 TO-N1.3 - - - 4 TO-N3.1 18 15 17 5 TO-N3.2 - - - 6 TO-BN1.1 - + + 7 TO-BN1.2 - - - 8 TO-BN1.3 18 21 9 9 TO-BN2.1 - 22 8 10 TO-BN2.2 - - - 11 TO-BN3.1 17 21 9 12 TO-BN3.2 17 22 7 13 TO-BN3.3 - - - 14 TO-BN3.4 17 12 4 15 TO-BN4.1 13 10 13
32 16 TO-BN4.2 - - - 17 TO-BT1.1 - - - 18 TO-BT1.2 - - - 19 TO-BT2.1 - 6 23 20 TO-BT2.2 - - - 21 TO-BT2.3 - - - 22 TO-BT2.4 - 5 - 23 TO-BT3.1 - 26 - 24 TO-BT3.2 - - - 25 TO-BT3.3 - - - 26 BL1 8 11 27 BL2 13 8 5 28 BL3 15 14 8 29 N1.4 30 29 24 30 TO-N1.5 13 27 5 31 TO-N1.6 13 20 - 32 TO-N3.3 21 25 5 33 TO-N3.4 18 23 - 34 TO-N3.5 23 25 3 35 TO-N3.6 17 25 3 36 TO-N3.7 13 23 6 37 BL4 15 26 6 38 BL5 18 25 6 39 BL6 - - - 40 BL7 25 25 12 41 TO-N2.1 13 23 3 42 TO-N2.2 15 23 6 43 TO-BN2.3 13 25 3
33 44 TO-BN3.5 13 25 6 45 TO-BN1.4 11 27 6 46 TO-BN1.5 - - - 47 TO-BN1.6 23 27 6 48 TO-BN4.3 23 25 7 49 TO-BN4.4 23 23 7 50 TO-BN4.5 23 23 6
Phát triển các chế phẩm sinh học trong trong nuôi trồng thuỷ sản từ các loài vi sinh vật bản địa là hướng đi đúng đắn của các cơ sở nghiên cứu khoa học nhằm
hướng đến mục tiêu giảm và dừng sử dụng hoá chất và kháng sinh. Trong số 50
khuẩn lạc thuần nghiên cứu, có 13/50 khuẩn lạc khơng có khả năng sinh enzyme ngoại bào hoặc có sinh enzyme nhưng rất yếu. 37 /50 khuẩn lạc có khả năng sinh từ 2 đến 3 loại enzyme kiểm định. Trong đó chủng N1.4 cho khả năng sinh 2
enzyme amylase, cellulase cao nhất và hoạt tính protease khá cao. Chủng này được chọn lọc để nghiên cứu tiếp.
Khả năng sinh tổng hợp 3 loại enzyme amylase, cellulase và protease trên
mơi trường có bổ sung cơ chất tương ứng lần lượt là tinh bột, CMC và casein được thể hiện trên hình 4.1.
34
35
Khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định
Khả năng kháng khuẩn của các chủng phân lập được từ ruột tôm được xác
định dựa trên kích thước vịng ức chế đối với các vi sinh vật gây bệnh trên đĩa thạch (như mô tả phần phương pháp). Kết quả về khả năng kháng khuẩn của các chủng phân lập được trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Khả năng kháng khuẩn của các chủng phân lập được từ ruột tơm
Vịng ức chế của các vi sinh vật gây bệnh (mm)
TT
Tên E.coli S.aureus V.harveyi
V. parahaemolyticus ĐC* 13 19 23 23 1 TO-N1.1 - - - - 2 TO-N1.2 - - - - 3 TO-N1.3 - - - - 4 TO-N3.1 - - - - 5 TO-N3.2 - - - - 6 TO-BN1.1 - - - - 7 TO-BN1.2 - - - - 8 TO-BN1.3 - - - - 9 TO-BN2.1 - - - - 10 TO-BN2.2 - - - - 11 TO-BN3.1 - - - - 12 TO-BN3.2 - - - - 13 TO-BN3.3 - - - - 14 TO-BN3.4 - - - - 15 TO-BN4.1 - - - - 16 TO-BN4.2 - - - - 17 TO-BT1.1 - - - - 18 TO-BT1.2 - - - -
36 19 TO-BT2.1 - - - - 20 TO-BT2.2 - - - - 21 TO-BT2.3 - - - - 22 TO-BT2.4 - - - - 23 TO-BT3.1 - - - - 24 TO-BT3.2 - - - - 25 TO-BT3.3 - - - - 26 BL1 - - - - 27 BL2 - - - - 28 BL3 - - - - 29 N1.4 - 12 11 12 30 TO-N1.5 - 12 - 2 31 TO-N1.6 - 5 - - 32 TO-N3.3 - 9 - - 33 TO-N3.4 - 9 - 2 34 TO-N3.5 - 10 - 2 35 TO-N3.6 - 10 - 1 36 TO-N3.7 - 11 - 2 37 BL4 - 5 - - 38 BL5 - 5 - - 39 BL6 - + - - 40 BL7 - + - - 41 TO-N2.1 - 2 - - 42 TO-N2.2 - 3 - - 43 TO-BN2.3 - 5 - - 44 TO-BN3.5 - 5 - - 45 TO-BN1.4 - 11 - - 46 TO-BN1.5 - - - -
37
47 TO-BN1.6 - 10 - +
48 TO-BN4.3 - 8 - +
49 TO-BN4.4 - 9 + -
50 TO-BN4.5 - 9 2 +
*ĐC - đối chứng, 30 µl dung dịch khánh sinh streptomycin (0,1 g/L)
Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.3 cho thấy 31/50 chủng khơng có khả năng
kháng khuẩn.
Kết quả cho thấy 19/50 chủng phân lập cho khả năng kháng khuẩn từ 1 đến 3 chủng vi khuẩn kiểm định. Khơng có chủng nào cho khả năng kháng cả 4 chủng vi khuẩn kiểm định. Trong số các chủng có khả năng kháng khuẩn, chủng N1.4 cho khả năng kháng 3 vi khuẩn kiểm định (S.aureus, V.harveyi, V.
parahaemolyticus) với kích thước vịng kháng khuẩn lần lượt là 12, 11 và 12 mm.
Khơng có chủng vi khuẩn phân lập nào cho khả năng kháng vi khuẩn E.coli
Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh đường ruột động vật (E.coli, S.aureus, V.harveyi, V. parahaemolyticus) của các chủng phân lập
38
39
Trong nghiên cứu này, từ các chủng phân lập từ ruột tôm cho thấy, 13/50 chủng không sinh tổng hợp các loại enzyme amylase, cellulase và protease, các chủng còn lại có khả năng sinh tổng hợp ít nhất 1 trong 3 loại enzyme trên.
Trong đó, có 37/50 chủng có khả năng sinh tổng hợp 3 loại enzyme này.
Chủng N1.4 sinh tổng hợp 2 loại amylase và cellulase rất mạnh, hoạt tính protease yếu hơn nhưng cũng rất tiềm năng. Hầu hết các chủng đều khơng có khả năng kháng hoặc kháng yếu 2 chủng vi khuẩn kiểm định là E.coli, Vibrio harveyi.
Có 7/50 chủng có khả năng ức chế Vibrio parahaemolyticus và 21/50 chủng có khả năng kháng S.aureus.
Từ các kết quả phân tích về hoạt tính sinh tổng hợp enzyme thủy phân, cũng
như khả năng kháng vi khuẩn kiểm định, chủng N1.4 thể hiện tiềm năng cả về sinh
enzyme thủy phân và khả năng sinh chất bacteriocin cao hơn các chủng phân lập cịn lại. Do đó, chủng N1.4 được tuyển chọn, định danh và nghiên cứu tiếp.
4.2. Định danh đến loài chủng vi sinh vật được tuyển chọn
DNA tổng số của chủng N1.4 được tách và tinh sạch được sử dụng để nhân
đoạn gen trên 16S-RNA. Trình tự 16S-r RNA được xác định và trình bày trên hình
40
Hình 4.3. Trình tự đoạn gen của rARN 16S của chủng vi khuẩn chọn lọc N1.4
Từ đoạn trình tự được giải mã của chủng N1.4 trên, tiến hành tìm kiếm
những trình tự nucleotide của các chủng tương đồng với trình tự của chủng N1.4 trên website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ để xây dựng cây phân loại, nhằm so
sánh và tìm ra nguồn gốc của chủng chọn lọc N1.4. Cây phân loại được lập dựa vào phần mềm là Mega và FlinchTV.
Sự tương đồng về trình tự nucleotide của N1.4 và 13 trình tự nucleotide được tải về từ Genbank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) và mối quan hệ về mặt
nguồn gốc phát sinh của N1.4 với 13 chủng vi khuẩn đó được thể hiện trong hình 4.4 như sau:
41
Hình 4.4. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn chọn lọc N1.4 với các trình tự gen trên GenBank có mức độ tương đồng cao nhất
Căn cứ vào cây phân loại và bảng so sánh mức độ tương đồng về trình tự
nucleotide của chủng vi sinh vật N1.4 và trình tự gen của 13 chủng vi khuẩn
Bacillus (trên Genbank) đã được biết trình tự có thể rút ra một số nhận xét như
sau:
- Chủng N1.4 có chung nguồn gốc phát sinh với 13 chủng vi khuẩn Bacillus có trình tự xác định trên Genbank, do đó có thể khẳng định chủng N1.4 là một
chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus.
- Trong 13 chủng Bacillus này, có 2 chủng: Bacillus sp. JN14, Bacillus sp.
CZB20 là chưa được xác định rõ thuộc loài nào, tuy nhiên căn cứ vào mức độ
tương đồng về nucleotide và cây phân loại có thể dự đốn N1.4 thuộc lồi
Bacillus subtilis.
- Chủng N1.4 có hệ số tương đồng rất cao với 13 chủng so sánh, hệ số này là 99.85%. Trên hình vẽ cây phân loại chỉ ra rằng, N1.4 có mối quan hệ gần gũi nhất về mặt di truyền với chủng B.subtilis LFB112 (tỷ lệ tương đồng 99.85%).
42
Từ các chủng phân lập được, kết quả định danh chủng vi khuẩn N1.4 thuộc loài Bacillus subtilis dựa trên trình tự rADN 16S. Chủng vi khuẩn tiềm năng B.
subtilis N1.4 này có khả năng sinh bacteriocin ức chế mạnh vi khuẩn kiểm định
(S.aureus, V.harveyi, V. parahaemolyticus) và sinh enzyme (amylase, cellulase, protease) thủy phân cơ chất tương ứng như chất bột, cellulose và protein.
4.3. Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin
4.3.1. Ảnh hưởng của hoạt tính kháng khuẩn qua các thế hệ nuôi cấy
Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của các chủng phân lập được qua các thế hệ từ 2 đến 5 trên môi trường LB, 37°C sau 24 giờ được trình bày trên hình 4.5.
Hình 4.5. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của các chủng phân