CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2. Định danh đến loài chủng vi sinh vật được tuyển chọn
4.3.2. Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy của chủng Bacillus subtilis N1.4
43
Thực hiện các thí nghiệm theo mơ tả trong mục 3.3.3, kết quả các nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng của chủng Bacillus subtilis N1.4
được trình bày trên bảng 4.4:
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến chủng Bacillus subtilis N1.4
Yếu tố nghiên cứu Max
OD
Max AU/ml
LB lỏng cơ bản 2,9 40
NB lỏng cơ bản 3,2 60
LB được chọn lọc bổ sung với:
CuSO4, NaHCO3,NaNO3, MnSO4, KCl, CaCl2, MgCl2,
ZnSO4 4,3 140
CuSO4, NaHCO3, NaNO3, MnSO4 0,6 80 KCl, CaCl2, MgCl2, ZnSO4 3,2 140 KCl, MgCl2 2,3 280 CaCl2, ZnSO4 2,7 300 CuSO4, NaNO3 2,4 80 MnSO4, NaHCO3 2,5 290 KCl 2,8 140 MgCl2 3,7 140 CaCl2 2,9 80 ZnSO4 2,4 80 NaNO3 2,8 40 MnSO4 5,4 140 CuSO4 2,8 40 NaHCO3 2,5 80
Môi trường nuôi cấy được pha chế gồm môi trường LB có bổ sung các chất dinh dưỡng theo các phương án khác nhau. Mơi trường LB có bổ sung các chất
44
phụ gia (CaCl2, ZnSO4) cho hoạt tính bacteriocin cao nhất (300 AU /ml) và mật
độ quang học (OD) đạt 2,7 trong quá trình sinh trưởng của chủng N1.4.
Mơi trường LB có bổ sung khống chất CaCl2, ZnSO4 này này được sử
dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.3.2.2. Nghiên cứu điều kiện lên men cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Bacillus subtilis N1.4
Thực hiện các thí nghiệm theo mô tả trong mục 3.3.3, ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng sinh kháng khuẩn bacteriocin của chủng N1.4 được trình bày trong bảng 4.5.
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của điều kiện lên men cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin
STT Yếu tố nghiên cứu
AU ở mỗi giá trị nghiên cứu của các yếu tố ảnh hưởng
1 Tốc độ khuấy vòng/phút 140 150 160 170 180 200 220 AU/ml 80 140 200 280 300 280 240 2 pH môi trường 4 5 6 7 8 9 10 AU/ml 60 150 265 312 240 160 130 3 Nhiệt độ (oC) lên men 31 33 35 37 39 41 43 45 AU/ml 120 180 280 345 270 220 140 100 4 Mật độ giống (cfu/ml) 106 107 108 AU/ml 140 351 250
5 Thời gian lên men (giờ)
24 48 72 96
AU/ml 220 381 280 240
* Thí nghiệm sau sẽ sử dụng giá trị tối ưu của thí nghiệm nghiên cứu trước đó nếu
45
Bảng 4.5 cho thấy, chủng B.subtilis N1.4 lên men trong môi trường được chọn lọc kết hợp với các điều kiện lên men cho những kết quả như sau:
- Tốc độ khuấy 180 vịng/phút cho hoạt tính AU cao nhất
- Ở pH 7,0 cho hoạt tính cao nhất;
- Ở nhiệt độ 37oC cho hoạt tính cao nhất;
- Ở mật độ giống ban đầu 107 cfu/ml cho hoạt tính cao nhất;
- Sau 48 giờ lên men cho hoạt tính cao nhất.
Như vậy, kết quả nghiên cứu các điều kiện lên men cho thấy cho thấy, khi
kết hợp các yếu tố tối ưu như môi trường tối ưu LB g/l ( pepton 10, cao thịt bò 10, NaCl 5) và có bổ sung CaCl2, ZnSO4 mỗi loại 1 mM, pH 7,0, ni lắc 180 vịng/phút, ở 37oC, 48 giờ lên men, giống 107 cfu/ml cho hoạt tính cao 381 AU/ml.
4.3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính kháng khuẩn
Thời gian lên men có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng N1.4 đối với các chủng kiểm định (bảng 4.6).
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng kháng khuẩn
Đường kính vịng ức chế (mm)
Thời gian
(giờ) E.coli Salmonella S.aureus V.harveyi V.paraheamolyticus
24 - 2 8 - 2
48 - 13 15 - 14
72 - 2 7 - 3
96 - + 7 - 2
120 - + 5 - +
Từ kết quả đạt được cho thấy, chủng N1.4 khơng có khả năng kháng E.coli và V.harveyi, trong khi đó, hoạt tính kháng Salmonella và V.paraheamolyticus
giảm dần sau 48 giờ lên men. Hoạt tính kháng S.aureus đạt giá trị cao nhất sau 48 giờ (15mm) và giảm dần sau đó.
46
Sau 48 giờ lên men, hoạt tính kháng khuẩn đạt cao nhất, tại các thời gian lên men khác hoạt tính kháng khuẩn có giá trị thấp hơn. Thời gian 48 giờ lên men
được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.1.1.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính enzyme thuỷ phân
Thời gian lên men có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme thuỷ phân, sinh tổng hợp được từ chủng N1.4 (bảng 4.7).
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính enzyme thủy phân
Thời gian (giờ) Đường kính vịng phân giải cơ chất (mm)
Amylase Cellulase Protease
24 + 10 11
48 31 30 24
72 21 19 17
96 + 8 11
120 + 9 14
Sau 48 giờ lên men hoạt tính enzyme thuỷ phân thu được đạt cao nhất. Hoạt
tính enzyme cellulase và protease qua các ngày lên men cũng có sự khác nhau nhưng khơng nhiều.
Thời gian 48 giờ được lựa chọn để lên men sinh enzyme cho chủng N1.4.