CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.4. Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin quy mô
4.4.3. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của dịch bacteriocin và hoạt tính enzyme
Dịch lên men chủng N1.4 được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH 1N ở các pH khác nhau trong dải từ 3-12 ở 37°C. Sau 2 giờ, dịch lên men được trung hoà về pH ban đầu và đưa đi ly tâm ở 10000 rpm/min trong 5 phút rồi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính enzyme (bảng 4.10).
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn cịn lại (%) sau xử lý ở pH khác nhau
pH E.coli Salmonella S.aureus V.harveyi V.paraheamolyticus
3 0 75 100 0 0 4 0 75 100 0 0 5 0 75 100 0 40 6 0 75 100 0 75 7 (đ/c) 0 100 100 0 75 8 0 100 100 0 75 9 0 100 100 0 75 10 0 75 100 0 75 11 0 + 100 0 0 12 0 - 83,88 0 0
Từ kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn kiểm định có sự khác nhau giữa các chủng.
Sau khi được xử lí trong dải pH từ 3-12, dịch lên men của chủng phân lập
vẫn có khả năng kháng S.aureus, Salmonella, V.paraheamolyticus và hoạt tính giảm nhẹ ở pH trong các khoảng 3-5 và 11-12.
Ảnh hưởng của enzyme thủy phân (protease) đến hoạt tính của bacteriocin
Dịch lên men chủng N1.4 được ly tâm ở 10000 rpm/min trong 5 phút và thu dịch nổi. Sau đó, dịch nổi được xử lý bởi các enzyme khác nhau là Lysozyme, Amylase, Protease và Trypsin ở nồng độ cuối là 1g/L và ủ ở 37°C trong 2 h. Dịch
52
sau xử lý được dùng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kết quả được trình bày trên bảng 4.11.
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của protease đến hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin
Hoạt tính (%) kháng khuẩn cịn lại sau xử lý bởi protease
Enzyme Salmonella
typhi S.aureus V.harveyi
V.paraheamolytic us ĐC 100 100 - 100 Lysozyme 83,33 83,33 - 100 Amylase 100 75 - 75 Protease K 100 75 - 100 Trypsin 100 100 - 100
Hình 4.7. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của chủng N1.4 trên môi trường ở 37°C
Từ kết quả thu được cho thấy, các enzyme hầu như khơng có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn kiểm định. Kết quả sau xử lí có sự thay đổi
53
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận:
- Quá trình phân lập đã thu được một số chủng có khả năng kháng khuẩn cao từ ruột tơm nước mặn, trong đó chủng N1.4 là chủng cho hoạt tính kháng khuẩn cao và ổn định nhất trong số 50 chủng phân lập.
- Kết quả phân tích một phần trình tự nucleotide vùng V1-V9 của 16S RNA ribosomal của chủng chọn lọc N1.4 có độ tương đồng cao (99%) so với loài
Bacillus subtilis.
- Khi kết hợp các yếu tố môi trường LB g/l ( pepton 10, cao thịt bò 10, NaCl
5) và có bổ sung CaCl2, ZnSO4 mỗi loại 1 mM, pH 7,0, ni lắc 180 vịng/phút, ở 37oC, 48 giờ lên men, tỷ lệ tiếp giống 107 cfu/ml cho hoạt tính cao 381 AU/ml.
- Chủng N1.4 có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất sau 48 giờ
lên men, kháng S.aureus ATCC 25923, Salmonella typhi, V.paraheamolyticus.
Bacteriocin ổn định trong khoảng nhiệt độ 37-70°C, pH 6-10 và không nhạy cảm với protease (hoạt tính bacteriocin bền khi xử lý với Lysozyme, Amylase, Protease K, Trypsin), sau xử lý vẫn duy trì khả năng kháng vi khuẩn Salmonella
typhi, S.aureus, V.paraheamolyticus.
Đề nghị:
Tiếp tục thực hiện các nghiên cứu thu nhận chế phẩm bacteriocin quy mô pilot và sản xuất qui mô công nghiệp. Chế phẩm sinh học Bacteriocin sẽ được sản xuất và đóng gói, thương mại, ứng dụng rộng rãi trên thị trường, có thể chủ động bổ sung trực tiếp vào thức ăn chăn nuôi tơm với một lượng đủ để tăng cường tiêu hố, giảm hại khuẩn, cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng cường sức khoẻ và
kháng bệnh cho tôm một cách phù hợp và hiệu quả, đáp ứng xu thế phát triển
ngành nuôi trồng thuỷ sản và phát triển kinh tế - xã hội Việt nam và đảm bảo chất
54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2021). Hiệu quả mơ hình ni tơm siêu
thâm canh cơng nghệ cao.
2. Lại Thúy Hiền (1998). “Một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa của một số chủng vi
khuẩn khử sulphat phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ”, Tạp chí sinh học, 8: 33-38
3. Lê Thị Trúc Linh (2016). “Xác định các gen đích trực tiếp của microRNA -144 trong tế bào chondrocyte”, Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ, 29(4), 133 – 139. 4. Lê Văn Cát, Đỗ Thị Hồng Nhung, Ngô Ngọc Cát (2006), Nước nuôi thủy sản:
Chất lượng và biện pháp cải thiện chất lượng, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật, Hà Nội.
5. Ngô Tự Thành (2001), “Sự phân bố, sinh trưởng và sinh tổng hợp protease ngoại bào của Bacillus ở vùng Hà Nội”, Tạp chí sinh học 23: 153-157.
6. Nguyễn Hữu Thọ (2001), “Biến động của sulfite, ammonia, nitrite, BOD, COD, chlo hữu cơ trong môi trường nước ảnh hưởng đến khả năng xảy ra bệnh đốm
trắng, bệnh đàu vàng trên tơm ni ở Khánh Hịa”. Tạp chí thủy sản, 43, Bộ Thủy
sản - Trung tâm nghiên cứu thủy sản III: 5-15.
7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học,
NXB Giáo dục, Hà Nội.
8. Vũ Trung Tạng (2001), Cơ sở sinh thái học, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội.
9. Austin, B.; Zhang, X.H., (2006), "Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates”, Lett. Appl. Microbiol., 43, 119–124.
10. Balcázar, J.L.; Blas, I.d.; Ruiz-Zarzuela, I.; Cunningham, D.; Vendrell, D.; Múzquiz, J.L., (2006), “The role of probiotics in aquaculture”. Vet. Microbiol.,
114, 173–186.
11. Bomba, A.; Nemcová, R.; Mudronová, D.; Guba, P., (2002), “The possibilities of potentiating the efficacy of probiotics”, Trends Food Sci. Technol., 13, 121–126. 12. Boyd C. E. and Tucker C. S. (1998). “Pond aquaculture water quality
55
13. Cabello, F.C., (2006), “Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a
growing problem for human and animal health and for the environment”, Environ.
Microbiol., 8, 1137–1144.
14. Cahill, M.M. (1990), “Bacterial flora of fishes: A review”, Microb. Ecol., 19, 21– 41.
15. Daba et al., (1991). “Detection and Activity of a Bacteriocin Produced by
Leuconostoc mesenteroides”, Applied microbiology and biotechnology 15 (3): 228
- 233.
16. De Vuyst, L. (1994), “Nisin production variability between natural Lactococcus lactis subsp. lactics strains”, Biotechnol. Lett, 16: pp. 287 – 292
17. Dorrington, T.; Gomez-Chiarri, M. (2008), “Antimicrobial Peptides for Use in
Oyster Aquaculture: Effect on Pathogens, Commensals, and Eukaryotic Expression Systems”, J. Shellfish Res., 27, 365–374.
18. Ercolini, D., G. Moschetti, G. Blaiotta, S. Coppola. (2001), “Behavior of variable V3 region from 16S rDNA of lactic acid bacteria in denaturing gradient gel
electrophoresis”, Curr. Microbiol. 42, 199-202.
19. Flegel, T.W., (2012), “Historic emergence, impact and current status of shrimp
pathogens in Asia”, Journal of Invertebrate Pathology 110:166-173.
20. Fooks, L.J., R. Fuller, G.R. Gibson. (1999), Prebiotics, probiotics and human gut microbiol. 22, 133-144
21. Fuller, R., (1989), “Probiotics in man and animals”, J. Appl. Microbiol., 66, 365– 378.
22. Holzapfel, W.H., P.Haberer, R. Geisen, J. Bjorkroth, U. Schillinger. (2001).
“Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food
nutrition”, Am. J. Clin. Nutr. 73, 365S-373S.
23. Joerger, R.D. , (2003), “Alternatives to antibiotics: bacteriocin, antimicrobial
56
24. Karpiński T.M., A.K. Szkaradkiewicz, (2016), Bacteriocin in Encyclopedia of Food and Health.
25. Karthikeyan, V., S.W. Santosh. (2009). “Isolation and partila characterization of bacteriocin produced from Lactobacillus plantarum”, African Journal of Microbiology Research, Vol 3: pp. 233 – 239.
26. Kesarcodi-W, A.; Kaspar, H.; Lategan, M.J.; Gibson, L. , (2008), “Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening
processes”, Aquaculture, 274, 1–14.
27. Kurath, G. (2008), “Biotechnology and DNA vaccines for aquatic animals”, Rev.
Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 27, 175–196.
28. Lightner, D.V., R. M. Redman, C. R. Pantoja, ph.D., B. L. Noble, Loc Tran, (2012), “Early Mortality Syndrome Affects Shrimp in Asia”, Global Aquaculture
Advocate, January/February 2012:40.
29. Loc Tran, L. Nunan, R. M. Redman, L. L. Mohney, C. R. Pantoja, K. Fitzsimmons, D. V. Lightner, (2013), “Determination of the infectious nature of the agent of
acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp”, Diseases of
aquatic organisms. 105: 45–55.
30. Marcogliese, D. , (2008), “The impact of climate change on the parasites and
infectious diseases of aquatic animals”, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 27, 467–
484.
31. Moriarty, D.J.W. , (1998), “Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds”, Aquaculture, 164, 351–358.
32. Musa, H.H.; Wu, S.L.; Zhu, C.H.; Seri, H.I.; Zhu, G.Q. (2009), “The Potential
Benefits of Probiotics in Animal Production and Health”, J. Anim. Vet. Adv., 8, 313–321.
33. Parker, R.B., (1974), “Probiotics, the other half of the antibiotic story”, Anim. Nutr. Health, 29, 4–8.
57
34. Parada, Carolina Ricoy Caron, Adriane Bianchi P. Medeiros, Carlos Ricardo Soccol. (2007), “Bacteriocins from lactic acid bacteria: purification, properties
and use as biopreservatives”, Journal of food engineering 45 (2): 123-129. 35. Reid, G.; Sanders, M.E.; Gaskins, H.R.; Gibson, G.R.; Mercenier, A.; Rastall, R.;
Roberfroid, M.; Rowland, I.; Cherbut, C.; Klaenhammer, T.R. (2003). “New
Scientific Paradigms for Probiotics and Prebiotics”, J. Clin. Gastroenterol., 37,
105–118.
36. Riaz, S., S. K. Nawaz and S. Hasnain (2010), “Bacteriocin produced by L. fermentum and L. acidophilus can inhibit cephalosporin resistant E. coli”, Brazilian J. of Microb. 41: pp. 643 – 648.
37. Salminen, S.; Ouwehand, A.; Benno, Y.; Lee, Y.K. (1999), “Probiotics: how should they be defined”, Trends Food Sci. Technol., 10, 107–110.
38. Sambrook and Russell (2001). Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Vols 1, 2 and 3.
39. Schillinger and Lucke. (1989), “Antibacterial activity of Lactobacillus sake
isolated from meat”, J. Clin. Gastroenterol., 41, 267-273.
40. Sirirat Dengripat et all (1998), “Effects of probiotic bacterium on black tiger
shrimp Penaeus monodon survival and growth”, Aquaculture 167, 45-50. 41. Tinh, N.; Dierckens, K.; Sorgeloos, P.; Bossier, P. (2008), “A review of the
functionality of probiotics in the larviculture food chain:, Mar. Biotechnol., 10, 1– 12.
42. Todorov, S.D., and M.T. Dicks. (2007), “Bacteriocin production by Lactobacillus
pentosus ST712Bz isolated from Boza”. Brazilian Journal of Microbiology 38:
pp. 166-172.
43. Toranzo, A.E.; Magariños, B.; Romalde, J.L. (2005), “A review of the main
bacterial fish diseases in mariculture systems”, Aquaculture, 246, 37–61.
44. Triona O'Keeffe, Colin Hill, (1999), Future Prospects for Bacteriocin in Food,
58
45. Vázquez, J. A., M. P. González and M. A. Murado (2005), “Effects of lactic acid bacteria cultures on pathogenic microbiota from fish” Aquaculture, 245: pp. 149
– 161.
46. Verschuere, L.; Rombaut, G.; Sorgeloos, P.; Verstraete, W. (2000), “Probiotic
Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture”, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 655–671.
47. Wang-Xiang-Hong, LiJun, JiWei-Shang, Xu-Huai-Shu (2002),
“Application of Probiotics in Aquaculture”, Ocean University of Chindo, China,
May 20:145-147.