2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 01 năm 2011 đến tháng 12 năm
2015 tại: Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội,
Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện K trung ương, Bệnh viện Việt Đức, Bệnh
viện Hữu Nghị, Bệnh viện Ung bướu Hà Nội và Bệnh viện 198 Bộ Công an.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư đại trực tràng, điều trị tại: Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện K Trung ương, Bệnh viện Việt Đức, Bệnh
viện Hữu Nghị, Bệnh viện Ung bướu Hà Nội và Bệnh viện 198, Bộ Công an.
2.1.2.1. Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh nghiên cứu
Thỏa mãn đồng thời ba tiêu chuẩn sau:
- Được chẩn đoán xác định ung thư đại trực tràng bằng xét nghiệm mô bệnh học.
- Đồng ý xét nghiệm gen KRAS, BRAF. - Đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ khỏi nghiên cứu
- Người bệnh có kèm ung thư cơ quan khác và/hoặc không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.2.3. Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh điều trị đích
Thỏa mãn đồng thời ba tiêu chuẩn sau:
- Ung thư đại trực tràng không đột biến gen KRAS, BRAF;
- Ung thư đại trực tràng giai đoạn IV và/hoặc tái phái và/hoặc khơng đáp ứng với hóa chất bổ trợ;
2.1.2.4. Tiêu chuẩn loại trừ điều trị đích
- Ung thư đại trực tràng có đột biến gen KRAS, BRAF. - Khơng đồng ý điều trị đích.
2.1.3. Vật liệu, hoá chất, máy thiết bị phục vụ cho nghiên cứu gen KRAS, BRAF
2.1.3.1. Vật liệu, hóa chất:
Các hóa chất và vật tư tiêu hao đều được mua từ các cơng ty có uy tín với độ tinh khiết và chất lượng cao.
- Hóa chất tách chiết DNA từ mô ung thư đại trực tràng:
Ethanol 100%, dung dịch xylene, lysis buffer (50mM Tris pH8, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20), dung dịch SDS 10%, dung dịch Protein K (nồng độ
1 mg/ml).
- Hóa chất tinh sạch DNA:
Ethanol 100%, ethanol 70%, sodium acetate 3M, pH5,2, lysis buffer (50mM Tris pH8, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20), dung dịch SDS 10%, dung dịch Protein K (nồng độ 1 mg/ml), dung dịch phenol/chloroform/isoamyl tỷ lệ 25/24/1, dung dịch chloroform/isoamyl tỷ lệ 24/1.
- Hóa chất PCR (In vitrogen):
Dung dịch đệm 10X, hỗn hợp dNTP, Taq polymerase, Mg2+, nước cất; Mồi đặc hiệu.
- Vật liệu, hóa chất điện di sản phẩm PCR:
Agarose, dung dịch TBE (boric acid EDTA); Ethidium bromide, loading dye, thước đo DNA.
- Hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR:
Promega Wizard SV gel clearn-up system (Promega Inc) gồm dung dịch gắn kết màng, dung dịch rửa màng, nước cất khơng có nuclease.
- Hóa chất đọc trình tự gen: BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction
BigDye Terminator v3.0 (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), BigDye buffer, Mồi đặc hiệu;
Dung dịch formamide.
- Hóa chất read-time PCR theo kỹ thuật Scorpion ARMS: KRAS PCR kit và BRAF PCR kit (Quiagen) gồm:
+ Hóa chất kiểm tra chất lượng DNA sử dụng cặp gen nội chuẩn GAPDH:
Master mix cho phản ứng PCR (dNTP, MgCl2, buffer, taq polymerase) Cặp mồi GAPDH: 5’ – ACA TGT TCC AAT ATG ATT CC – 3’
5’ – TGG ACT CCA CGA CGT ACT CA – 3’
Marker 100, 50bp, thạch agarose 1,5% điện di kiểm tra kích thước sản phẩm PCR.
+ Hóa chất kiểm tra chất lượng DNA với cặp mồi nội chuẩn và các cặp mồi đột biến để xác định các đột biến đã biết sử dụng kỹ thuật Scorpions
ARMS:
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất thực hiện phản ứng Scorpions ARMS xác định đột biến gen KRAS.
Bảng 2.2. Danh mục hóa chất thực hiện phản ứng scorpions ARMS xác định đột biến gen BRAF
!
2.1.3.2. Máy thiết bị:
Tủ lạnh âm sâu (-30oC, -80oC), máy hấp vơ trùng, lị vi sóng, bồn ủ
nhiệt, buồng hút, máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh, hệ thống điện di
Mupid (Nhật Bản), máng đổ gel, lược tạo giếng, máy soi và chụp ảnh tự động thạch agarose đã điện di: Dolphin Chemic Wealtec (USA), máy đo quang phổ (định nồng độ DNA, RNA): Thermo Electron Corporation (Biomate), máy ly tâm nhiệt Gene Amp PCR System 9700 (USA), máy luân nhiệt định lượng
Stratagen MX 3000P, máy đọc trình tự gen 3100-Avant Genetic Analyzer