PHƢƠNG TIỆN - PHƢƠNG PHÁP
2.3 Phƣơng tiện thí nghiệm
Đĩa petri, bình tam giác, chai thủy tinh, micropipet, bọc nilon, đèn cồn, đũa cấy, kim mũi giáo, ống đục trịn, kéo, kẹp, giấy thấm, hóa chất, giấy nhám, cọ …
Tủ thanh trùng khô, tủ thanh trùng ƣớt, tủ úm, tủ cấy, cân điện tử, máy đo pH, kính soi nổi, kính hiển vi, lame, lamelle, lam đếm, nồi chƣng cách thủy,…
Các trái bƣởi bệnh và các trái bƣởi dùng để lây bệnh nhân tạo đƣợc thu mua tại các vựa bƣởi ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long.
2.1.1 Các loại mơi trƣờng đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Mơi trƣờng Water - agar (WA)
Agar 20g
Nƣớc cất 1000ml
Môi trƣờng Potato - dextrose - agar (PDA)
Khoai tây 200g
Đƣờng dextrose 20g
Agar 20g
Nƣớc cất 1000ml
pH 6,7
Môi trƣờng Oatmeal - agar (OA) (EPPO, 2009) Yến mạch 30g
Agar 20g Nƣớc 1000ml
2.1.2 Địa điểm thí nghiệm
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm Nedo và phịng chủng bệnh của Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ từ tháng 5 năm 2012 đến tháng 3 năm 2013.
2.2 Phƣơng pháp thí nghiệm
2.2.1 Thu thập mẫu bệnh
Thu mua mẫu bệnh tại các vựa bƣởi ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long. Các mẫu bƣởi đƣợc thu về đƣợc cho vào bọc nilon và tồn trữ ở 25oC cho đến khi quan sát.
Các trái bƣởi đƣợc thu là bƣởi có những triệu chứng bệnh đốm trái thể hiện rõ trên bề mặt vỏ trái, với số lƣợng đốm xuất hiện tƣơng đối nhiều.
2.2.2 Phƣơng pháp xác định tác nhân gây bệnh đốm trái bƣởi Nguyên tắc giám định Nguyên tắc giám định
Nấm đƣợc định danh dựa vào các đặc điểm ổ nấm, tản nấm, bào tử, phụ bộ và đƣợc giám định theo 4 bƣớc của quy tắc Koch (Agrios, 2005).
Bốn bƣớc xác định nấm gây hại theo quy tắc Koch, gồm: Bƣớc 1: Mô tả triệu chứng vết bệnh trên vỏ trái bƣởi.
Bƣớc 2: Phân lập tách ròng và định danh mầm bệnh.
Quan sát tác nhân gây bệnh dƣới kính soi nổi: ghi nhận màu sắc bên trong, rìa vết bệnh, cách mọc của ổ nấm trong vết bệnh và chụp hình ghi nhận.
Quan sát dƣới kính hiển vi và xác định tên nấm gây bệnh: Tiến hành phẩu thức vết bệnh và quan sát dƣới kính hiển vi để mơ tả hình dạng, màu sắc của ổ nấm, bào tử, phụ bộ bào tử, ghi nhận kích thƣớc (tiến hành đo ngẫu nhiên kích thƣớc của 20 ổ nấm và 30 bào tử dƣới kính hiển vi quang học ở vật kính X40, sau đó lấy trung bình), chụp hình.
Xác định tên nấm gây bệnh: dựa vào khóa phân loại nấm của Barnett và Hunter (1998), tài liệu „„Phyllosticta citriasiana sp. nov., the cause of Citrus tan spot of Citrus maxima in Asia‟‟ của Wulandari và ctv (2009), „„Guignadia citricarpa‟‟ của European and Mediterranean Plant Protection Organization (2009),
„„Phyllosticta species associated with citrus diseases in China‟‟ của Xinghong Wang và ctv (2011) và các tài liệu đã báo cáo khác.
Phân lập: chọn vết bệnh làm trung tâm, cắt một phần mơ bƣởi xung quanh dạng hình vng cạnh 5mm, dày 3mm, sau đó cắt chia ra hai phần bằng nhau. Cho mẫu vào ngâm trong cồn 70o
khoảng 3 phút, rửa lại với nƣớc cất thanh trùng hai lần, sau đó để lên giấy thấm thanh trùng cho ráo nƣớc hoàn toàn, cho mẫu vào đĩa petri chứa môi trƣờng WA, 4 mẫu/đĩa. Mẫu phân lập đƣợc để ở 25o
C, sau 4 - 5 ngày khi những tản nấm màu đen, rìa màu trắng phát triển thì tiến hành tách rịng sang mơi trƣờng PDA.
Tách ròng: hay làm thuần bằng phƣơng pháp cấy đơn bào tử hay đỉnh sinh trƣởng sợi nấm theo phƣơng pháp của Burgess và ctv. (2009) và cất trữ nguồn nấm để thực hiện các thí nghiệm kế tiếp. Quan sát sự phát triển của tản nấm trên môi trƣờng PDA, ghi nhận các chỉ tiêu nhƣ màu sắc, cách mọc trên mơi trƣờng, tiến hành đo đƣờng kính của tản nấm trên môi trƣờng PDA ở thời điểm 14 ngày sau khi nuôi cấy.
Bƣớc 3: Lây nhiễm nhân tạo mầm bệnh đã phân lập vào trái khỏe. Quan sát
lại triệu chứng bệnh xuất hiện.
Nguồn nấm: Chọn những lá bƣởi trƣởng thành, sạch bệnh, ngâm trong cồn 70o khoảng 2 phút để thanh trùng bề mặt, rửa lại với nƣớc cất thanh trùng, để ráo; sau đó cắt một phần cuống để vừa vào đĩa petri, có giấy thấm và nƣớc cất thanh trùng bên dƣới để giữ ẩm. Đục những khoanh khuẩn ty nấm có đƣờng kính 1cm để lên bề mặt lá trong đĩa petri, khoảng 8 khoanh cho một đĩa. Sau 5-6 ngày, những khoanh khuẩn ty đã tạo ra những ổ nấm và bào tử tuôn ra thành những khối nhờn từ những ổ nấm. Cho những khoanh khuẩn ty vào ống nghiệm với 5ml nƣớc cất thanh trùng, đem lắc trên máy vontex để phân tán bào tử tạo dung dịch huyền phù. Đếm
mật số bào tử trong dung dịch huyền phù bằng lam đếm sau đó thêm nƣớc cất để mật số đạt khoảng 106
-107 cfu/ml.
Chọn những trái bƣởi có tuổi trƣởng thành, kích thƣớc tƣơng đối đồng đều và quan trọng là khơng có xuất hiện những đốm bệnh trên vỏ trái. Trái đƣợc rửa sạch bụi đất với nƣớc sau đó thanh trùng bề mặt bằng cách ngâm trong cồn 70o khoảng 2 phút và chiếu sáng bằng đèn cực tím 20 phút. Tạo vết thƣơng trên bề mặt vỏ trái để nấm dễ xâm nhiễm vào bằng cách dùng miếng giấy nhám chà lên bề mặt vỏ trái, nhẹ và đều tay để tạo nên những vết xƣớc cạn trên bề mặt vỏ trái, những túi tinh dầu có thể vỡ ra. Để yên khoảng 4-5 giờ cho những tinh dầu bị vở ra mất đi khả năng kháng khuẩn.
Tiến hành lây bệnh nhân tạo: dùng cọ quét 1ml dung dịch bào tử lên bề mặt trái đã tạo vết thƣơng, trái đối chứng đƣợc tiến hành với 1ml nƣớc cất thanh trùng. Sau đó cho trái và bọc nilon đƣợc phun sƣơng và có gịn thấm nƣớc bên trong để tạo ẩm độ, buộc kín bọc lại, để trái ở 25oC và ủ tối trong ba ngày đầu. Theo dõi từng ngày để quan sát và ghi nhận lại những biến đổi của trái cho đến khi thể hiện triệu chứng bệnh và đến khi trái bị hƣ hại hồn tồn, chụp hình ghi nhận lại.
Bƣớc 4: Tái phân lập mầm bệnh từ vết bệnh đƣợc tiêm chủng và so sánh với
mầm bệnh lúc ban đầu.
2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng một số yếu tố đến sự phát triển của nấm gây hại 2.2.3.1 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy 2.2.3.1 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy nấm trên môi trƣờng PDA và môi trƣờng OA; để ở nhiệt độ phịng, trong đĩa petri đƣờng kính 70 mm. Cấy khoanh nấm có đƣờng kính 9 mm vào đĩa petri chứa môi trƣờng PDA và môi trƣờng OA, theo dõi sự phát triển của tản nấm, ghi nhận hình dạng, kích thƣớc, màu sắc.
Trên môi trƣờng OA, chú ý đến đặc điểm có hay khơng hình thành sắc tố vàng lan tỏa ra xung quanh môi trƣờng khi nấm phát triển. Đây là một trong những đặc điểm quan trong trong việc định danh loài nấm gây bệnh.
2.2.3.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nấm gây bệnh đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA và để ở hai điều kiện nhiệt độ: điều kiện phịng thí nghiệm khơng kiểm sốt đƣợc nhiệt độ và trong phòng lạnh nhiệt độ 25oC . Cấy khoanh nấm có đƣờng kính 9 mm vào 20 đĩa petri đƣờng kính 70 mm chứa mơi trƣờng PDA, sau đó để 10 đĩa nhiệt độ phòng và 10 đĩa ở 25oC. Ghi nhận đƣờng kính tản nấm ở thời điểm 14 NSKC và quan sát mô tả đặc điểm tản nấm.
2.2.4 Phƣơng pháp thử nghiệm hiệu quả một số thuốc hóa học
Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức và 10 lần lập lại.
Bảng 2.1 Nồng độ hoạt chất thuốc và liều lƣợng thuốc sử dụng
Tên hoạt chất Nồng độ khuyến cáo cao nhất Nồng độ hoạt chất (ppm) Lƣợng thuốc pha cho 300 ml PDA Azoxystrobin 7ml/bình 8 L 0,219 262,5 μl Difenoconazole 10ml/bình 8 L 0,313 375,0 μl Copper hydroxide 25g/bình 16 L 0,841 0.465 g Carbendazim 15g/bình 8 L 0,938 0,570 g Chlorothalonil 30g/bình 10 L 2,250 0,900 g Thiophanate-Methyl 8g/bình 8 L 0,700 0,300 g
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong đĩa petri, pha thuốc trực tiếp vào môi trƣờng PDA. Cấy khoanh nấm có đƣờng kính 9 mm vào giữa đĩa petri đƣờng kính 90 mm, sau đó để ở nhiệt độ 25oC.
Các chỉ tiêu cần ghi nhận:
Quan sát biến đổi của tản nấm mỗi ngày (sợi nấm mọc ngang, mọc đứng lên, màu sắc, sự hình thành ổ nấm…).