Chương 1 : TỔNG QUAN
2.1.3. Dạng bào chế
Thuố c đư ợ c bào chế dư ớ i dạ ng viờn nang, hàm lư ợ ng 0,54g/viờn, đúng lọ 30 viờn. Cỏc vị thuố c đư ợ c kiể m nghiệ m và bào chế
theo tiờu chuẩ n dư ợ c liệ u do Bộ Y tế quy đị nh.
Loại tạp, lọc
Nước sạch Nấu sụi 3 giờ
Thu cao bỏn thành phẩm
Gộp cỏc dịch cụ Xỏc định tỷ trọng Bó dược liệu
(nấu sụi 3 giờ) Nước sạch Lọc
Phun sấy (Độ ẩm 5%) Dược liệu đó sơ chế đạt
tiờu chuẩn, cõn đủ số llượnglượng Chất bảo quản qqqqqququnqu ản Dịch chiết 1 cụ riờng Lọc Dịch chiết 2 cụ riờng
Sơ đồ 2.1. Cỏc giai đoạn sản xuất
Rõy / KBC-SH2D-20B/ lưới 2,0 mm cao khụ Lipidan, Silic dioxyd dạng keo khan tinh bột ngụ, Natri starch glycolat
Dập viờn/ Rimex-RSP-16
hoặc Rimex-Unik-EC
Bao viờn/ KBC-BP-80 Khối lượng lớp bao: 10 mg
ẫp vỉ/ EVN-35A/ 10 viờn
đúng lọ/ 45 viờn Cảm quan chai Độ kớn chai Mỏy sấy tầng sụi FL-120 Nhiệt độ: 55-600 C,
thời gian sấy 40 –60 phỳt, độ ẩm: 3 – 5% Sửa hạt /KBC-SH2D-20A / lưới 1,0 mm Ethanol 96%
Xuất xưởng thành phẩm
Kiểm tra Thành phẩm đúng gúi và lưu Đúng gúi (vụ hộp, vụ thựng)
Trộn khụ/ HSM-100/ 3 phỳt
Nhồi/ HSM-100/ 3 - 5 phỳt
Rõy qua lưới 0,5mm
Magnesi Stearat Trộn hoàn tất/ KBC-LP2G-200/ 10 phỳt Kiểm nghiệm Kiểm nghiệm Kiểm nghiệm Dịch bao
Sơ đồ 2.2. Qui trỡnh sản xuất2.2. Đối tượng nghiờn cứu 2.2. Đối tượng nghiờn cứu
2.2.1. Nghiờn cứu trờn động vật
- Chuột nhắt trắng (Mus musculus) chủng Swiss, khoẻ mạnh, cả hai giống trọng lượng trung bỡnh 25 ± 2g (để nghiờn cứu tỏc dụng trờn lipid mỏu) và 20 ± 2g (nghiờn cứu độc tớnh cấp) do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
- Chuột cống trắng cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 150 - 180g. - Thỏ chủng Oryctolagus cuniculus, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 1,8- 2,5 kg do Trung tõm dờ - thỏ Sơn Tõy (Viện chăn nuụi) cung cấp.
Động vật thực nghiệm được nuụi 3- 5 ngày trước khi nghiờn cứu và trong suốt thời gian nghiờn cứu bằng thức ăn chuẩn riờng cho từng loại (do Cụng ty liờn doanh Guyomarc’h-VCN và Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp), uống nước tự do.
2.2.2. Nghiờn cứu trờn lõm sàng
Người cú hội chứng rối loạn lipid mỏu được đưa vào diện nghiờn cứu.
2.2.2.1. Cỡ mẫu
Cụng thức được sử dụng để tớnh cỡ mẫu đỏnh giỏ sự thay đổi hàm lượng cholesterol trước và sau điều trị.
n =
22 (Z1-/2 + Z1-)2 (1 - 1)2
n: cỡ mẫu tối thiểu; : độ lệch chuẩn từ nghiờn cứu thử nghiệm = 0,55 z 1-/2 = 1,96; z 1-= 0,842
2: hàm lượng cholesterol sau điều trị là 5,70 (Nghiờn cứu thử 10 BN). Như vậy, theo tớnh toỏn số bệnh nhõn cần cho nghiờn cứu là 85, thực tế chọn 90 bệnh nhõn.
2.2.2.2. Tiờu chuẩn chọn bệnh nhõn vào diện nghiờn cứu
- Bệnh nhõn hai giới (nam và nữ)điều trị tại Bệnh viện YHCT Bộ Cụng an.
- Chưa từng được điều trị bằng một thuốc RLLPM nào hoặc nếu được điều trị rồi thỡ cũng đó ngừng cỏc thuốc đú ớt nhất 3 thỏng, khụng dựng cỏc thuốc cú thể gõy RLLPM.
- Khụng phõn biệt giới tớnh, nghề nghiệp. - Tuổi ≥ 30
- Tự nguyện tham gia nghiờn cứu này. * Tiờu chuẩn chọn bệnh nhõn theo YHHĐ
Bệnh nhõn cú hội chứng RLLPM thoả món điều kiện [24], [42]: + CT ≥ 6,5 mmol/l, LDL-C ≥ 4,2 mmol/l
+ Hoặc TG > 2,3 mmol/l
+ Hoặc CT từ 5,2 - 6,2 mmol/l, HDL-C < 0,91 mmol/l.
Bệnh nhõn được chọn vào nghiờn cứu cú số đo huyết ỏp tõm thu từ 110 - 139 mmHg, huyết ỏp tõm trương 70 - 89 mm Hg (thuộc giai đoạn tiền tăng huyết ỏp theo JNC VII, thỏng 6 năm 2003).
* Tiờu chuẩn chọn bệnh nhõn theo YHCT (thể tỳ hư đàm thấp và thể tỳ thậndương hư) [13], [103], [104].
Tứ chẩn Tỳ hư đàm thấp Tỳ thận dương hư
Vọng lưỡi bệu, cú vết hằn răng, rờu trắng nhớt, hỡnh thể mập
lưỡi bệu, rờu trắng, hỡnh thể mập Văn núi bỡnh thường, nhỏ yếu, núi to núi bỡnh thường, nhỏ yếu, núi to
Vấn ăn kộm, chậm tiờu, tứ chi ró rời, chướng bụng, tờ nặng chõn tay, tờ nặng thõn
đau lưng, mỏi gối, ự tai, tiểu đờm, hoa mắt, chúng mặt, bụng chướng, ăn kộm
Thiết mạch hoạt, cơ nhẽo mạch trầm tế, cơ nhẽo
2.2.2.3. Tiờu chuẩn loại trừ bệnh nhõn ra khỏi diện nghiờn cứu (YHHĐ)
- Bệnh nhõn cú hội chứng RLLPM thứ phỏt sau cỏc bệnh: thiểu năng giỏp, đỏi thỏo đường, hội chứng thận hư, suy gan, suy thận.
- Bệnh nhõn rối loạn tiờu hoỏ kộo dài ảnh hưởng tới hấp thu và chuyển húa thuốc, phụ nữ cú thai, đang cho con bỳ, người bị suy dinh dưỡng, người bệnh tõm thần, người đang sử dụng thuốc ảnh hưởng đến chuyển hoỏ lipid.
- Bệnh nhõn mắc cỏc bệnh nhiễm khuẩn, bệnh cấp tớnh kốm theo.
- Bệnh nhõn nghiờn cứu nhưng khụng chấp hành đỳng theo tiờu chuẩn nghiờn cứu (khụng uống thuốc đỳng quy định, dựng thờm thuốc khỏc...).
- Bệnh nhõn đang thực hiện chế độ ăn kiờng.
2.3. Địa điểm thực hiện nghiờn cứu
2.3.1. Nghiờn cứu trờn thực nghiệm
Nghiờn cứu độc tớnh và tỏc dụng trờn động vật thực nghiệm được tiến hành tại Bộ mụn Dược lý trường Đại học Y Hà Nội và Bộ mụn Dược lý - Học viện Quõn Y.
2.3.2. Nghiờn cứu trờn lõm sàng
Nghiờn cứu được tiến hành tại Bệnh viện Y học cổ truyền Bộ Cụng an, thời gian nghiờn cứu trờn lõm sàng 10/2013- 7/2014.
2.4. Cỏc trang thiết bị, húa chất phục vụ cho nghiờn cứu
2.4.1. Cỏc trang thiết bị, húa chất phục vụ cho nghiờn cứu thực nghiệm
- Cholesterol tinh khiết (Merck - Đức).
- Propylthiouracil viờn nộn 50 mg (Biệt dược Lothisil đ của hóng Young IL Pharma Hàn Quốc).
- Acid cholic (Sigma- Singapore) - Poloxamer 407 (Sigma - Singapore)
- Atorvastatin viờn nộn 10mg - biệt dược Lipistad (hóng STADA- Việt Nam). - Kit định lượng cỏc enzym và chất chuyển hoỏ trong mỏu: ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần, protein, cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-cholesterol và creatinin của hóng Hospitex Diagnostics (Italy) và hóng DIALAB GmbH (Áo).
- Dung dịch xột nghiệm mỏu ABX Minidil LMG hóng ABX- Diagnostics.
- Cỏc hoỏ chất xột nghiệm và làm tiờu bản mụ bệnh học.
- Mỏy Vet abcTM Animal Blood Counter của hóng Ugo- Basile (Italy).
- Mỏy xột nghiệm sinh húa A25 Biosystem- Tõy Ban Nha (Nghiờn cứu độc tớnh bỏn trường diễn).
- Mỏy xột nghiệm sinh húa XC- 55- Trung Quốc.
2.4.2. Cỏc trang thiết bị, húa chất phục vụ cho nghiờn cứu trờn lõm sàng
- Dụng cụ, mỏy múc phục vụ xột nghiệm cận lõm sàng: bơm kim tiờm, pipet, ống nghiệm, huyết ỏp kế đồng hồ của Nhật Bản, cõn đồng hồ.
- Mỏy huyết học tự động Cell- dyn 1700 của hóng ABBOT (Mỹ).
- Mỏy sinh húa bỏn tự động photometer 4010 của hóng Boehringer.- Mannheim.
- Húa chất: Hoỏ chất của hóng J.T. Baker (Thụy Điển); Kit thử của hóng Celtrolic và hóng Easylab (Đức).
2.5. Phương phỏp nghiờn cứu
2.5.1. Nghiờn cứu độc tớnh cấp và độc tớnh bỏn trường diờ̃n của Lipidan
2.5.1.1. Nghiờn cứu độc tớnh cấp
Chuột nhắt trắng được chia thành từng lụ, mỗi lụ 10 con.
Cho từng lụ chuột uống thuốc thử Lipidan với liều từ liều cao nhất khụng gõy chết tới liều thấp nhất gõy chết 100% chuột. Chuột được nhịn ăn 12 giờ trước khi uống thuốc, vẫn uống nước đầy đủ.
Theo dừi số chuột chết trong 72 giờ đầu và tỡnh trạng chung của chuột trong 7 ngày sau khi uống thuốc (ăn uống, hoạt động, đi lại, bài tiết, ...).
Nếu chuột chết, mổ đỏnh giỏ đại thể tổn thương của cỏc cơ quan. Xỏc định liều chết 50% (LD50) theo tỷ lệchuột chết trong vũng 72 giờ đầu.
2.5.1.2. Nghiờn cứu độc tớnh bỏn trường diễn
Độc tớnh bỏn trường diễn trờn thỏ theo đường uống được tiến hành theo hướng dẫn của WHO [106].
Thỏ được chia làm 3 lụ, mỗi lụ 12 con, mỗi con nhốt riờng một chuồng. - Lụ chứng: uống nước cất 5ml/kg/ngày
- Lụ trị 1: uống Lipidan liều 0,3 g/kg/ngày (liều cú tỏc dụng tương đương trờn người, tớnh theo hệ số 3).
- Lụ trị 2: uống Lipidan liều 1,5 g/kg/ngày (gấp 5 lần lụ trị 1)
Thỏ được uống nước hoặc thuốc thử với thể tớch đồng nhất 5 ml/kg/ngày trong 6 tuần liền, mỗi ngày một lần vào buổi sỏng.
2.5.1.3. Cỏc chỉ tiờu theo dừi trước và trong quỏ trỡnh nghiờn cứu - Tỡnh trạng chung, thể trọng của thỏ.
- Đỏnh giỏ chức phận tạo mỏu thụng qua số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, cụng thức bạch cầu, số lượng bạch cầu và tiểu cầu.
- Đỏnh giỏ tổn thương gan thụng qua hoạt độ enzym ALT, AST trong mỏu.
- Đỏnh giỏ chức năng thận bằng định lượng nồng độ ure, creatinin huyết thanh.
- Cỏc thụng số theo dừi được kiểm tra tại 3 thời điểm: trước khi uống thuốc, sau 3 tuần và sau 6 tuần uống thuốc.
cỏc cơ quan. Kiểm tra ngẫu nhiờn cấu trỳc vi thể gan, thận của 30% số thỏmỗi lụ.
2.5.2. Đỏnh giỏ tỏc dụng của Lipidan trờn mụ hỡnh gõy rối loạn lipid mỏu thực nghiệm. thực nghiệm.
2.5.2.1. Mụ hỡnh gõy rối loạn lipid mỏu theo cơ chế nội sinh
Sử dụng và điều chỉnh mụ hỡnh gõy tăng lipid mỏu nội sinh bằng Poloxamer 407 (P- 407) theo Millar và cộng sự [107].
Chuẩn bị dung dịch P- 407 2 % bằng cỏch pha 0,4 g P- 407 trong 20 ml nước muối sinh lý,để tủ lạnh qua đờm để làm tăng độ tan của P- 407.
Chuột nhắt trắng được chia làm 5 lụ, mỗi lụ 10 con.
+ Lụ 1 (chứng trắng): uống nước cất hàng ngày, ngày thứ 7 tiờm màng bụng nước muối sinh lý 10 ml/kg.
+ Lụ 2 (mụ hỡnh): uống nước cất hàng ngày, ngày thứ 7 tiờm màng bụng P- 407 liều 200mg/kg.
+ Lụ 3 (chứng dương): uống atorvastatin liều 100 mg/kg hàng ngày, ngày thứ 7 tiờm màng bụng P- 407 liều 200mg/kg.
+ Lụ 4 (Lipidan liều1): uống Lipidan liều 6,0g/kg hàng ngày, ngày thứ 7 tiờm màng bụng P- 407 liều 200mg/kg.
+ Lụ 5 (Lipidan liều 2): uống Lipidan liều 12,0g/kg hàng ngày, ngày thứ 7 tiờm màng bụng P- 407 liều 200mg/kg.
Chuột được uống Lipidan, atorvastatin hoặc nước cất trong 7 ngày. Vào ngày thứ 7, chuột ở cỏc lụ (trừ lụ 1) được tiờm màng bụng P- 407. Tất cả cỏc chuột được nhịn ăn trong 24 giờ, uống nước tự do. Ngày thứ 8, 24 giờ kể từ khi tiờm P- 407, tất cả cỏc chuột được lấy mỏu động mạch cảnh làm xột nghiệm định lượng triglycerid (TG), cholesterol toàn phần (TC), HDL- cholesterol (HDL- C).
Chỉ số non- HDL- cholesterol (cholesterol khụng phải HDL) được tớnh bằng cụng thức:
Non- HDL- C = (TC) - (HDL- C)
2.5.2.2. Mụ hỡnh gõy rối loạn lipid mỏu theo cơ chế ngoại sinh
Mụ hỡnh gõy tăng lipid mỏu theo cơ chế ngoại sinh được tiến hành theo phương phỏp của Nassiri và cộng sự (2009) [108] cú điều chỉnh hàm lượng acid cholic và PTU theo nghiờn cứu của Nguyễn Phương Thanh (2011) [109].
Cho chuột uống hỗn hợp dầu cholesterol bao gồm: cholesterol, acid cholic, propylthiouracil (PTU) pha trong dầu lạc (bảng 2.1) với hàm lượng 10 ml/kg/ngày trong 4 tuần.
Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp dầu cholesterolThành phần Mụ hỡnh Nassiri Mụ hỡnh đó điều chỉnh Thành phần Mụ hỡnh Nassiri Mụ hỡnh đó điều chỉnh Cholesterol (g/mL) 0,1 0,1 Acid cholic (g/mL) 0,1 0,01 PTU (g/mL) 0,03 0,005 Dầu lạc vừa đủ 1 mL 1 mL
Chuột cống được chia thành 5 lụ, mỗi lụ 10 con với tỉ lệ đực/cỏi như nhau ở mỗi lụ.
Cỏc lụ chuột được uống thuốc hàng ngày trong 4 tuần như sau: Nước + nước
Lụ 1 (n = 10) Tuần 0 2 4
Lụ 2 (n = 10) Tuần
0 2 4 Dầu cholesterol + Atorvastatin
Lụ 3 (n = 10) Tuần 0 2 4 Dầu cholesterol + Lipidan liều1
Lụ 4 (n = 10) Tuần 0 2 4 Dầu cholesterol + Lipidan liều 2
Lụ 5 (n = 10) Tuần 0 2 4
Sơ đồ 2.3. Quy trỡnh nghiờn cứu thực nghiệm
+ Lụ 1 (chứng trắng): hàng ngày chuột uống nước cất với thể tớch 1ml/100g thể trọng.
+ Lụ 2 (mụ hỡnh): hàng ngày chuột được uống hỗn hợp dầu cholesterol 1ml/100g thể trọng.
+ Lụ 3 (chứng dương): hàng ngày chuột uống hỗn hợp dầu cholesterol ml/100g thể trọng và Atorvastatin 10mg/kg thể trọng.
+ Lụ 4 (Lipidan liều 1): hàng ngày chuột được uống hỗn hợp dầu cholesterol 1ml/100g thể trọng và Lipidan 0,7g /kg thể trọng (liều cú tỏc dụng tương đương trờn người, tớnh theo hệ số 7).
+ Lụ 5 (Lipidan liều 2): hàng ngày chuột được uống hỗn hợp dầu cholesterol 1ml/100g thể trọng và Lipidan 1,4g/kg thể trọng.
Thuốc thử và thuốc chứng dương được uống 2 giờ sau khi uống hỗn hợp dầu cholesterol.
Tiến hành cõn trọng lượng chuột ở tất cả cỏc lụ tại thời điểm trước, sau nghiờn cứu 1, 2 và 4 tuần.
Tại thời điểm trước nghiờn cứu, sau 2 tuần và sau 4 tuần, chuột được nhịn ăn qua đờm (vẫn uống nước tự do), lấy mỏu đuụi chuột để định lượng cỏc chỉ số lipid mỏu: Cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), HDL cholesterol (HDL- C) và tớnh chỉ số non- HDL- cholesterol.
2.5.3. Đỏnh giỏ tỏc dụng của viờn nang Lipidan trong điều trị rối loạn lipid mỏu ở người bệnh. mỏu ở người bệnh.
2.5.3.1. Phương phỏp nghiờn cứu
Thử nghiệm lõm sàng mở, so sỏnh trước và sau điều trị.
2.5.3.2. Tiến hành nghiờn cứu
* Chọn 90 bệnh nhõn, trong đú 45 bệnh nhõnthể tỳ hư đàm thấp (nhúm A) và 45 bệnh nhõn thể tỳ thận dương hư (nhúm B).
- Bệnh nhõn được khỏm 2 lần độc lập, qua 2 bàn khỏm tại bệnh viện YHCT Bộ Cụng an. Chọn 90 bệnh nhõn đủ tiờu chuẩn đưa vào diện nghiờn cứu.
- Làm bệnh ỏn: bệnh nhõn được khỏm lõm sàng, xột nghiệm cận lõm sàng vào thời điểm trước điều trị (D0) và sau 42 ngày điều trị (D42).
* Cỏch dựng thuốc (viờn nang Lipidan)
- Viờn nang Lipidan hàm lượng 0,54g/viờn.
- Cỏch dựng: mỗi ngày uống 9 viờn, chia làm 3 lần, mỗi lần 3 viờn, uống trướcăn 30 phỳt, uống thuốc liờn tục trong 42 ngày.
2.5.3.3. Cỏc chỉ số nghiờn cứu
- Chỉ số khối cơ thể (BMI): tớnh BMI cho bệnh nhõn vào thời điểm trước điều trị (D0), sau điều trị 42 ngày (D42), theo cụng thức:
[Chiều cao (m)]2
Trọng lượng cơ thể: cõn bệnh nhõn vào buổi sỏng, lỳc đúi.
Chiều cao: đo một lần lỳc bắt đầu điều trị bằng thước trờn cõn đồng hồ. - Mạch, huyết ỏp bệnh nhõn: đo huyết ỏp bệnh nhõn hàng ngày vào khoảng 8 đến 9 giờ sỏng ở tư thế nằm. Bệnh nhõn được nghỉ ngơi trước khi đo ớt nhất 15 phỳt. Lần khỏm đầu tiờn đo huyết ỏp ở cả 2 tay, ghi nhận số huyết ỏp ở tay nào cao hơn làm mốc theo dừi trong suốt thời gian nghiờn cứu. Bệnh nhõn khụng hỳt thuốc lỏ, khụng dựng chất kớch thớch hay bất kỳ một loại thuốc nào khỏc cú ảnh hưởng tới huyết ỏp.
- Chỉ số huyết học và sinh hoỏ mỏu: bệnh nhõn được lấy mỏu tĩnh mạch vào buổi sỏng (lỳc chưa ăn sỏng) và cỏch bữa ăn tối hụm trước ớt nhất là 12 giờ. Cỏc chỉ số theo dừi xột nghiệm gồm: Cụng thức mỏu, chỉ số lipid mỏu (cholesterol, triglycerid, HDL- C, LDL- C), chỉ số đỏnh giỏ chức năng gan, thận (ALT, AST, ure, creatinin), glucose mỏu.
Sơ đồ 2.4. Quy trỡnh nghiờn cứu trờn lõm sàng
2.5.3.4. Tiờu chuẩn đỏnh giỏ kết quả
* Đỏnh giỏ theo YHHĐ dựa trờn xột nghiệm cận lõm sàng:
Chia làm 4 loại dựa theo tiờu chuẩn nghiờn cứu lõm sàng của Bộ Y tế Trung Quốc [42],[110], [111]. - Loại tốt: đạt ớt nhất một trong cỏc mức độ: + CT giảm > 20% + TG giảm > 40% + HLD- C tăng≥ 0,259 mmol/l Chọn bệnh nhõn, làm bệnh ỏn
Sau 42 ngày điều trị (D42) Khỏm lõm sàng Xột nghiệm cận lõm sàng Nhúm B: Tỳ thận dương hư (D ) So sỏnh (D0 và D42, nhúm A với nhúm B) Nhúm A: Tỳ hư đàm thấp (D ) Hỏi và khỏm lõm sàng, làm cỏc xột nghiệm: húa sinh, huyết học
Bệnh nhõn
- Loại khỏ: đạt ớt nhất một trong cỏc mức độ: + CT giảm 10% - 20%.
+ TG giảm 20% - 40%.
+ HLD- C tăng từ 0,120- 0,258 mmol/l. + LDL- C giảm 3,900 - 4,90 mmol/l.
- Khụng hiệu quả: khụng thay đổi cỏc chỉ tiờu hoặc thay đổi ớt (ở dưới mức