Hàm lượng acrylamide trong cà phê được xác định theo phương pháp mơ tả ở mục 2.6.1.6.
2.5.2.3. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của pH trong quá trình xử lý L-Asparaginase đến hàm lượng acrylamide tạo thành trong cà phê Asparaginase đến hàm lượng acrylamide tạo thành trong cà phê
Mục đích: Xác định điều kiện pH phù hợp nhất trong quá trình xử lý L-Asparaginase
với cà phê trước khi rang.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với các mẫu cà phê (1.000 ± 0.0050g) sẽ được
xử lý với 2ml enzyme được khảo sát ở các pH khác nhau (pH = 5.0, pH = 6, pH = 7.3, pH = 8.6).
Các yếu tố cố định:
Nhiệt độ xử lý enzyme: t = 37oC; Nồng độ enzyme 3 IU/ml; Thời gian xử lý: 40 phút.
Yếu tố thay đổi: pH trong quá trình xử lý mẫu với enzyme
C0: 0IU/ml; P5: pH = 5.0; P6: pH = 6; P7.3: pH = 7.3; P8.6: pH = 8.6.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày ở hình 2.7.
Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm khảo sát pH trong q trình xử lý mẫu với enzyme
Cà phê xanh Sấy Rang P8.6 P7.3 P5 C0 Xử lý enzyme Xác định hàm lượng acrylamide P6 Nghiền
30
Hàm lượng acrylamide trong cà phê được xác định theo phương pháp mơ tả ở mục 2.6.1.6.
2.5.2.4. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý cà phê với L-Asparaginase đến sự tạo thành acrylamide trong sản phẩm Asparaginase đến sự tạo thành acrylamide trong sản phẩm
Mục đích: Xác định thời gian phù hợp nhất trong quá trình xử lý L-Asparaginase với
cà phê trước khi rang.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với các mẫu cà phê (1.000 ± 0.0050g) sẽ được
xử lý với 2ml enzyme được khảo sát ở các thời gian khác nhau (0; 20; 30; 40; 50; 60 phút).
Các yếu tố cố định:
Nhiệt độ xử lý enzyme: t = 37oC; pH = 7.3; Nồng độ của enzyme 3 IU/ml.
Yếu tố thay đổi: Thời gian xử lý mẫu với enzyme
C0: 0IU/ml (40 phút); T20: 20 phút; T30: 30 phút; T40: 40 phút; T50: 50 phút; T60: 60 phút. Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày ở hình 2.6:
Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian xử lý mẫu với enzyme
Cà phê xanh C0 Sấy Rang T50 T40 T30 T20 Xử lý enzyme Xác định hàm lượng acrylamide T60 Nghiền
31
Hàm lượng acrylamide trong cà phê được xác định theo phương pháp mô tả ở mục 2.6.1.6.
2.5.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đến sự tạo thành acrylamide trong cà phê (Robusta)
- Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm theo thời gian
Mục đích: Khảo sát sự thay đổi của độ ẩm theo thời gian tại 45oC, từ đó quyết định các mốc độ ẩm phù hợp để thực hiện xử lý enzyme.
Nguyên tắc: Mẫu cà phê được sấy đối lưu ở 45oC.
Cách thực hiện:
Chuẩn bị đĩa và nắp petri, sấy khô trong 1 giờ ở 105°C. Lấy đĩa và nắp ra khỏi tủ sấy và làm nguội đến nhiệt độ phịng trong bình hút ẩm. Cân khay và nắp chính xác đến 0.1 mg. Cân chính xác khối lượng cà phê cho vào đĩa petri, dàn đều trên đáy đĩa. Để nắp đậy bên cạnh hoặc phía dưới đĩa, cho vào tủ sấy và sấy ở 45°C. Cân và ghi lại khối lượng của mẫu sau mỗi khoảng thời gian xác định.
Tính độ ẩm từ cơng thức:
W = 𝑚1−𝑚2
𝑚1−𝑚0×100% (2.1)
Trong đó:
m0 là khối lượng của đĩa và nắp (g).
m1 là khối lượng của đĩa, phần mẫu thử và nắp trước khi sấy (g). m2 là khối lượng của khay, phần mẫu thử và nắp sau khi sấy (g). Kết quả là trung bình cộng của ba lần lặp lại.
Dựng đồ thị hàm ẩm của cà phê theo thời gian. Chọn 4 điểm trên đồ thị tương ứng với 4 độ ẩm khác nhau cần khảo sát.
- Bố trí thí nghiệm 6:
Mục đích: Khảo sát sự ảnh hưởng của độ ẩm đến sự hình thành acrylamide.
Cách thực hiện: Sau khi đã chọn được các độ ẩm tại mục 2.5.6, tiến hành thực hiện:
Chuẩn bị đĩa và nắp petri, sấy khô trong 1 giờ ở 105°C. Lấy đĩa và nắp ra khỏi tủ sấy rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm. Cân khay và nắp chính xác đến 0.1 mg. Cân 2g hạt cà phê/đĩa, sau đó để hạt cà phê lên đĩa trải đều, sấy ở nhiệt độ 45°C. Sau khi sấy đến 4 độ ẩm cần xác định acrylamide, tiến hành đo acrylamide tại 4 độ ẩm khác nhau đó, chuẩn bị mẫu, thực hiện đo acrylamide như mục 2.6.1.6.
2.6. Phương pháp phân tích
32
2.6.1.1. Xác định độ ẩm của cà phê
Nguyên tắc thực hiện theo TCVN 6928 : 2007: Nghiền mẫu để thu được dạng bột. Sấy
phần mẫu thử ở nhiệt độ từ 105oC ± 1oC trong thời gian 16 ± 0,5 giờ (đảm bảo thu được khối lượng không đổi).
Bố trí thí nghiệm: Sấy khơ đĩa petri và nắp đậy ở 105oC ± 1oC trong thời gian 1 giờ. Lấy khay và nắp ra khỏi tủ sấy và làm nguội đến nhiệt độ phịng trong bình hút ẩm. Cân khay và nắp chính xác đến 0,1 mg.
Sử dụng máy nghiền để giảm kích thước hạt cà phê. Trộn kỹ và cân khoảng 10g cà phê đã chuẩn bị, chính xác đến 0,1 mg vào khay đã biết khối lượng và dàn đều các hạt trên đáy khay. Để nắp đậy bên cạnh hoặc phía dưới khay có chứa mẫu thử vào tủ sấy được duy trì ở 105oC ± 1oC và sấy khơ trong 16 giờ ± 0,5 giờ. Đậy nắp và đặt vào bình hút ẩm. Để nguội đến nhiệt độ phịng, sau đó cân chính xác đến 0,1 mg. Tiến hành lặp lại 3 lần trên cùng một mẫu thử để xác định được độ chênh lệch. Sau đó tính phần trăm độ ẩm của mẫu cà phê.
Tính tốn kết quả:
Thành phần phần trăm khối lượng của hàm ẩm trong cà phê được tính theo cơng thức sau:
% ẩm = 𝑚1−𝑚2
𝑚1−𝑚0*100 (2.2)
Trong đó:
m0 là khối lượng của khay và nắp, tính bằng gam;
m1 là khối lượng của khay, phần mẫu thử và nắp trước khi sấy, tính bằng gam; m2 là khối lượng của khay, phần mẫu thử và nắp sau khi sấy, tính bằng gam.
Kết quả là trung bình cộng của ba lần xác định và độ lệch chuẩn tương ứng.
2.6.1.2. Xác định hàm lượng tro
Nguyên tắc thực hiện theo TCVN 5253:1990: Đốt và nung mẫu thử, sau đó xác định
phần cịn lại.
Bố trí thí nghiệm: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lị nung 550°C đến trọng lượng khơng
đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 0.001g.
Cân 5g cà phê mẫu cho vào chén sứ đã biết khối lượng. Dàn đều mẫu trên đáy chén và đốt nhẹ trên bếp điện cho đến khi mẫu cháy hết. Chuyển chén sứ vào đốt trong lò nung ở nhiệt độ 550 đến 6000C trong 2 giờ 30 phút, đến khi mẫu được tro hố hồn tồn, có màu trắng hoặc màu trắng xám hoặc màu xám. Làm nguội chén sứ trong bình hút ẩm khoảng 40 phút và đem cân.
Làm lặp lại quá trình nung mẫu cho đến khi khối lượng không đổi.
33
Hàm lượng tro tổng số của mẫu (X) tính bằng phần trăm theo cơng thức: X= B.100
A(1−0.01b) (2.3)
Trong đó:
A- Khối lượng mẫu dùng để phân tích, tính bằng g B- Khối lượng tro lấy được, tính bằng g
b- Độ ẩm của mẫu mang phân tích, tính bằng %
Làm ba mẫu song song, kết quả cuối dùng là trung bình cộng của hai lần xác định, sai số của phép không quá 0,2%.
2.6.1.3. Xác định hàm lượng lipid
Sử dụng phương pháp Soxhlet (Nielsen, S. S., 2010) và có một số thay đổi.
Nguyên tắc: Dùng dung mơi kỵ nước trích ly hồn tồn lipid từ ngun liệu đã được
nghiền nhỏ. Hàm lượng lipid tổng có thể được tính trực tiếp lượng dầu sau khi chưng cấy loại bỏ dung mơi hoặc tính gián tiếp thơng qua khối lượng bã cịn lại sau khi đã trích ly hồn tồn lipid bằng dung mơi.
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu cà phê đã sấy khơ hồn tồn sau đó được nghiền mịn.
Cho khoảng 2g mẫu cà phê đã được nghiền mịn vào túi giấy chuyên dùng cho bộ Soxhlet và xác định khối lượng của giấy gói. Chuyển mẫu vào trong trụ chiết. Sau đó, đổ dung mơi bao gồm dymethyl ether và petroleum ether theo tỷ lệ 1:1 từ phía trên ống sinh hàn chảy qua trụ chiết và cuối cùng chảy xuống bình đựng dung mơi. Mở nguồn nước làm lạnh ống sinh hàn và bật nguồn nhiệt để làm bay hơi dung môi. Dung môi bay hơi sẽ được làm lạnh bằng hệ thống ống sinh hàn và ngưng tụ, chảy xuống trụ chiết thực hiện q trình trích ly và chảy xuống bình đựng dung mơi.
Q trình trích ly hồn tồn lipid kéo dài trong khoảng 8 – 12 tiếng. Kiểm tra mẫu đã trích ly hồn tồn bằng cách lấy dung mơi từ trụ chiết nhỏ lên giấy lọc.
Dung mơi bay hơi hồn tồn khơng để vết loang dầu thì kết thúc. Tính thành phần phần trăm khối lượng lipid thu được.
Tính tốn kết quả:
Hàm lượng chất béo trong mẫu tính bằng % theo cơng thức: % Chất béo = 𝑚1− 𝑚2
𝐺 *100 (%) (2.4)
Trong đó:
m1: khối lượng của giấy (g)
m2: khối lượng của giấy và khối lượng của chất béo sau khi sấy (g) G: khối lượng mẫu (g)
34
2.6.1.4. Xác định hàm lượng protein
Sử dụng phương pháp Kjeldahl (Nielsen, S. S., 2010) và có một số thay đổi.
Nguyên tắc: Khi đốt nóng thực phẩm cần phân tích với H2SO4 đậm đặc (q trình vơ
cơ hóa mẫu). Sử dụng CuSO4 làm chất xúc tác để chuyển nito hữu cơ có mặt về dạng (NH4)2SO4. Dùng K2SO4 để tăng điểm sôi của H2SO4 và tạo hỗn hợp oxi hóa mạnh hơn cho việc vơ cơ hố mẫu. Bổ sung một lượng dư NaOH vào dịch phân hủy đã để nguội làm giải phóng NH3. NH3 ngưng tụ sẽ tác dụng với H2SO4tạo thành (NH4)2SO4. Định lượng H2SO4 0.1N dư bằng dung dịch NaOH 0.1N chuẩn, qua đó ta tính được lượng nito có trong mẫu ngun liệu cần phân tích.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị mẫu: nghiền mẫu cà phê bằng dụng cụ thích hợp.
Vơ cơ hóa mẫu: cân 1g mẫu bỏ vào ống Kjeldahl. Sau đó cho 0.075g chất xúc tác CuSO4, 1.25g chất trợ sôi K2SO4, 15 mL H2SO4 đậm đặc vào ống Kjeldahl.
Chuyển ống Kjeldahl vào thiết bị gia nhiệt, đậy kín bằng thiết bị hút khí độc. Gia nhiệt, phân hủy cho đến khi mẫu trở nên trong suốt.
Chưng cất: Mẫu sau khi được vơ cơ hóa được chuyển qua thiết bị chưng cất. Đặt bình erlen ở đầu ra của thiết bị chứa 15 mL dung dịch H2SO4 0.1N, lưu ý đầu ra của ống sinh hàn phải ngập trong dung dịch H2SO4. Cài đặt chương trình cho máy với các thông số (tỷ lệ sục hơi: 30%, thể tích NaOH 40%: 25 – 30 mL, thời gian phản ứng: 10 phút, thời gian chưng cất: 15 phút). Sau đó khởi động và cho máy chạy. Kết thúc quá trình lấy bình erlene đưa đi chuẩn độ lượng H2SO4 dư.
Chuẩn độ: Lấy erlen ra khỏi hệ thống; sau đó, cho 03 giọt phenolphtalein vào bình và chuẩn độ bằng NaOH 0.1N. Khi dung chuyển màu hồng nhạt, đọc buret chính xác đến 0.05ml.
Tính thành phần phần trăm protein của cà phê.
Tính tốn kết quả:
Hàm lượng (%) Nitơ tổng có trong mẫu: N = (a−bK)∗0.0014∗100
m (2.5)
Trong đó:
N – hàm lượng Nitơ tính bằng phần trăm khối lượng a – số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3 b – số mL dung dịch NaOH 0.1N sử dụng chuẩn độ m – khối lượng mẫu đem vơ cơ hóa, g
35
K – hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N (hệ số chuẩn độ được xem là bằng 1 nếu chúng ta sử dụng ống chuẩn)
2.6.1.5. Xác định đường khử trong hạt cà phê
Xác định lượng đường khử bằng phương pháp DNS (Nielsen, S. S., 2010).
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hợp chất tạo thành sẽ được xác định bằng thiết bị quang phổ UV-Vis và chuyển thành giá trị số. Giá trị cường độ màu của hợp chất tạo thành tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa vào phương trình đường chuẩn sẽ xác định được hàm lượng đường khử của mẫu thí nghiệm.
Hình 2.9. Phản ứng tạo màu giữa thuốc thử DNS và đường khử Cách tiến hành: Cách tiến hành:
Chuẩn bị hóa chất:
Thuốc thử DNS bao gồm: Nước cất: 60 – 70mL; NaOH rắn: 1,6g; DNS (C7H4N2O7): 1g; Muối natrikali tartrat (KNaC4H4O4.4H2O): 30g.
Khuấy tan hoàn toàn hỗn hợp bằng máy khuấy từ và định mực đến vạch 100mL bằng bình định mức. Thuốc thử được bảo quan trong điều kiện nhiệt độ thấp 2 – 8oC và không ánh sáng (dung dịch dùng tốt trong khoảng 10 – 15 ngày sau khi pha). Dung dịch glucose chuẩn 0.1%. Nước cất.
Chuẩn bị dịch trích ly đường từ cà phê: Mẫu cà phê được nghiền thành bột mịn. Cân 1g mẫu, gói gọn trong giấy lọc và thực hiện trích ly béo bằng phương pháp soxhlet (xem ở mục 2.6.1.3) để giảm hàm lượng chất béo có trong mẫu. Sau q trình trích ly chất béo đem mẫu sấy khơ đến khối lượng khơng đổi, đem mẫu trích ly bằng cồn 80o có khuấy từ gia nhiệt khoảng 70-80oC bằng thiết bị hồi lưu trong vịng 2h, sau đó lọc dịch bằng giấy lọc để thu được hết dịch đường. Sau đó đuổi hết cồn bằng trích ly cơ quay dịch mẫu với tốc độ 90 vịng/phút, nhiệt độ cơ quay là 50oC trong khoảng 3 phút, thu dịch trích, xác định thể tích và đo UV-Vis bước sóng 540nm. Tiến hành pha loãng mẫu sao cho độ hấp thụ nằm trong khoảng thích hợp. Đây là dung dịch có thể tạo phức để đo độ hấp thụ.
Tiến hành phản ứng và dựng đường chuẩn glucose
Sử dụng dung dịch glucose chuẩn 0.1%, mẫu và thuốc thử để chuẩn bị dãy ống nghiệm có thành phần như Bảng 2.2. Sau đó, chúng ta tiến hành các bước sau:
36
- Đun sôi cách thủy các ống nghiệm đã được chuẩn bị theo công thức ở Bảng 2.2 trong 5 phút; sau đó, làm nguội nhanh các ống nghiệm đến nhiệt độ phòng.
- Lấy khoảng 2-3 mL mẫu trong ống nghiệm cho vào Cuvet; sau đó, đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm bằng thiết bị quang phổ so màu.
- Dựa vào số liệu thu được, vẽ đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ đường khử và độ hấp thu xác định được bằng thiết bị quang phổ so màu.
- Viết phương trình đường chuẩn: A = f(C), xác định hệ số tương quang R.
Bảng 2.2. Thành phần dãy ống nghiệm trong phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử
DNS
STT ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Dung dịch chuẩn, mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0 0 Dung dịch mẫu, mL 0 0 0 0 0 0 0.3 0.3 0.3 Nước cất, mL 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2 2.7 2.7 2.7 Thuốc thử DNS, mL 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OD540nm Hàm lượng (mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 - - - Tính tốn kết quả:
Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được X mg/ml đường khử trong dung dịch đường pha lõang.
Nhân với hệ số pha loãng n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc. Chọn hệ số pha lõang n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn. Tính hàm lượng đường khử trong nguyên liệu (mg/g) = X∗n∗V
𝑚 (2.6)
V: thể tích dịch đường gốc (ml); m: khối lượng mẫu cân (g); n: là độ pha loãng mẫu.
2.6.1.6. Xác định hàm lượng acrylamide trong mẫu cà phê
Mục đích: Xây dựng đường chuẩn để xác định hàm lượng acrylamide ở mẫu phân tích. Cách tiến hành: Sự thay đổi của mật độ quang (OD) tới nồng độ của acrylamide được
xác định bằng phương pháp quang phổ dựa theo nghiên cứu của Palanti S. và cộng sự, 2015 với một vài thay đổi.
Cân một lượng 1mg acrylamide tinh khiết vào (1) 1000ml và sau đó định mức lên đúng thể tích với nước cất. Dùng pipette lấy ra 0.5ml chuyển vào bình định mức (2) 100ml, dùng NaOH 1M thêm vào lên đúng thể tích thu được dung dịch acrylamide với nồng độ 5 ng/ml (dung dịch gốc chuẩn A). Từ dung dịch gốc chuẩn A chuẩn bị dãy ống nghiệm với
37
các nồng độ acrylamide lần lượt là 0, 0.25; 0.5; 0.75; 1.00; 1.25; 1.50, 1.75; 2.00; 2.25; 2.50