Kết quả phân tích (hình 3.4) cho thấy, khi tăng thời gian rang từ 0 đến 7 phút thì hàm lượng acrylamide tạo thành tăng từ 1933.94 µg/kg đến 2927.82 µg/kg (tăng khoảng 34%) so với cà phê xanh ban đầu (C). Kết quả phân tích trên khá tương đồng với nghiên cứu của V. Gokmen và cộng sự (2009), nghiên cứu báo cáo rằng, hàm lượng acrylamide tạo thành tăng dần đều khi tăng thời gian rang. Một số báo cáo khác cũng chỉ ra rằng hàm lượng acrylamide tạo thành khá cao trong giai đoạn đầu của quá trình rang cà phê (EFSA, 2015; Lantz và cộng
sự, 2006; Skog và cộng sự, 2006; Taeymans và cộng sự, 2004).
Bên cạnh đó, chúng tơi cịn nhận thấy rằng hàm lượng acrylamide trong cà phê tăng vọt khi bắt đầu rang, đạt đến mức tối đa, sau đó lại giảm. Cụ thể từ 7 đến 8 phút thì hàm lượng acylamide giảm từ 2927.82 µg/kg xuống cịn 2378.59 µg/kg (khoảng 19%). Ngun nhân là do tốc độ phân hủy lớn hơn tốc độ hình thành acrylamide tại 225oC. Kết quả này cũng có sự tương đồng với nghiên cứu của Taeymans và cộng sự, 2004. Một nghiên cứu khác báo cáo như sau việc rang cà phê trong thời gian càng lâu dẫn đến hàm lượng acrylamide càng giảm (Bagdonaite và cộng sự, 2004). Ngoài ra, việc tăng thời gian rang dẫn đến sự phân hủy acrylamide, cịn dẫn đến sự hình thành các hợp chất có hương vị khơng mong muốn, làm giảm giá trị cảm quan bên ngoài của sản phẩm cà phê (Guenther và cộng sự, 2007).
Như vậy, thời gian rang 7 phút tại nhiệt độ 225oC là phù hợp cho quá trình rang cà phê. 1000 1500 2000 2500 3000 0 2 4 6 7 8 H àm lư ợ ng ac ry la m ide (m ic ro g/ kg) Thời gian (phút)
46
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của L- Asparaginase đến sự hình thành acrylamide trong cà phê trong cà phê
3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng acrylamide tạo thành trong quá trình xử lý cà phê (Robusta)
Độ hấp thụ acrylamide và hàm lượng acrylamide hình thành trong các mẫu cà phê được xử lý bằng L–Asparaginase với các nồng độ enzyme khác nhau được trình bày ở hình 3.5.
C là mẫu cà phê xanh không xử lý enzyme; C0, C3, C5, C7 là các mẫu cà phê được xử lý enzyme có nồng độ lần lượt là 0IU/ml, 3IU/ml, 5IU/ml, 7IU/ml
Hình 3.5. Độ hấp thụ của acrylamide (a) và hàm lượng acrylamide hình thành (b) trong các mẫu cà phê được xử lý với enzyme với các nồng độ khác nhau
Kết quả phân tích ở hình 3.5 (a) cho thấy độ hấp thụ acrylamide của các mẫu đều có đỉnh ở bước sóng 224nm. Độ hấp thụ acrylamide càng cao thì hàm lượng acrylamide tạo thành trong cà phê càng lớn. Mẫu cà phê xanh (C) khơng xử lý enzyme có độ hấp thụ acrymide cao nhất (0.49) có nghĩa là mẫu này chứa hàm lượng acrylamide nhiều nhất. Khi có mặt enzyme L- Asparaginase, độ hấp thụ acrylamide giảm. Điều này được giải thích là do dưới sự tác động của enzyme, một phần asparagine trong cà phê không kết hợp được với lượng đường khử để tạo thành acrylamide. Vì vậy, hàm lượng acrylamide giảm dẫn đến độ hấp thụ acrylamide cũng giảm và giảm mức thấp nhất là 0.37 ở mẫu xử lý enzyme có nồng độ là 3IU/ml (C3). Tuy nhiên, khi tăng nồng độ enzyme lên 5 và 7IU/ml, độ hấp thụ acrylamide có xu hướng tăng trở lại, nhưng vẫn thấp hơn mẫu C.
Kết quả phân tích ở hình 3.5 (b), thể hiện hàm lượng acrylamide hình thành giảm ở các mẫu cà phê có xử lý enzyme với các nồng độ khác nhau. Ở mẫu có nồng độ 0IU/ml (C0) được ngâm với nước và có điều chỉnh pH kết hợp với đánh sóng siêu âm, với thời gian như
0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 210 220 230 240 250 Ab s Bước sóng (nm) C C0 C3 C5 C7 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 C C0 C3 C5 C7 Hàm lượ ng a c ry la m id e (µg/k g) Mẫu a b
47
những nồng độ khác, kết quả cho thấy hàm lượng acrylamide tạo thành có sự giảm nhẹ so với mẫu C, nhưng khơng đáng kể (xử lý anova khơng có sự khác biệt). Nồng độ 3IU/ml (P3) cho kết quả giảm hàm lượng acrylamide thấp nhất là 1466.56 µg/kg, giảm khoảng 16% so với mẫu cà phê xanh (C) và khoảng 13% so với mẫu 0IU/ml (C0). Điều này được giải thích rằng, nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng lớn, khả năng chuyển hóa asparagine thành aspatic acid càng nhiều, gây hạn chế sự hình thành acrylamide (Schnell,
S., 2000). Khi nồng độ enzyme tăng lên 5IU/ml (C5) và 7IU/ml (C7), hàm lượng acrylamide
tăng lên so với mẫu C3 tương ứng là 1523.49 µg/kg và 1647.85 µg/kg. Có thể hiểu rằng, nếu tiếp tục tăng nồng độ enzyme, mật độ enzyme quá cao trong khi diện tích tiếp với hạt cà phê vẫn giữ nguyên gây khó khăn trong việc thẩm thấu enzyme vào hạt cà phê, dẫn đến hàm lượng acrylamide tăng trở lại ở nồng độ 5 và 7IU/ml.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự với nghiên cứu của Porto, (2019) với nồng độ enzyme 3IU có thể giảm hàm lượng acrylamide xuống mức thấp nhất. Bên cạnh đó, hiệu quả làm giảm hàm lượng acrylamide tạo thành của enzyme L-Asparaginase còn được báo cáo trong nghiên cứu của Hendriksen và cộng sự, (2013) đạt khoảng 55 – 74%.
Như vậy từ các phân tích bên trên, chúng tơi chọn nồng độ enzyme là 3IU/ml là thích hợp nhất cho quá trình xử lý bằng L - Asparaginase. Giá trị nồng độ này sẽ được sử dụng trong các khảo sát tiếp theo để đưa ra quy trình thích hợp trong việc làm giảm hàm lượng acrylamide tạo thành trong cà phê rang Robusta.
3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình xử lý L-Asparaginase đến hàm lượng acrylamide tạo thành trong cà phê (Robusta) lượng acrylamide tạo thành trong cà phê (Robusta)
Độ hấp thụ acrylamide và hàm lượng acrylamide hình thành trong các mẫu cà phê được xử lý bằng L – Asparaginase với các nhiệt độ khác nhau được trình bày ở hình 3.6.
Kết quả phân tích hình 3.6 thể hiện ở các nhiệt độ khác nhau, độ hấp thụ và hàm lượng acrylamide tạo thành sẽ khác nhau. Mẫu cà phê xanh (C) có độ hấp thụ acrylamide cao nhất (0.54) và thấp nhất là 0.45 ở mẫu 37oC (N37). Khi tiếp tục tăng nhiệt độ xử lý enzyme, độ hấp thụ của acylamide có xu hướng tăng trở lại nhưng vẫn thấp hơn mẫu C. Kết quả phân tích ở hình 3.6 (b) cho thấy hàm lượng acrylamide tạo thành trong các mẫu cà phê khi thay đổi yếu tố nhiệt độ. Mẫu cà phê xanh khơng xử lý enzyme (C) có hàm lượng acrylamide tạo thành nhiều nhất tương ứng là 2027.84 µg/kg và mẫu C0 (như đã phân tích ở dưới hình 3.6 (b) có hàm lượng acrylamide là 1974.51 µg/kg, giảm nhẹ so với mẫu C. Khi xử lý anova giữa hai mẫu này thì khơng có sự khác biệt. Khi có mặt enzyme asparaginase, hàm lượng acrylamide tạo thành ở các mẫu N30, N37 có xu hướng giảm rõ rệt so với mẫu cà phê xanh. nhưng sau đó lượng acrylamide tạo thành tăng trở lại khi tăng nhiệt độ lên 45 và 50oC ở mẫu N45, N50. Mẫu N37 có hàm lượng acrylamide thấp nhất là 1698.64 µg/kg, giảm 16% so với
48
mẫu cà phê xanh. Hàm lượng acrylamide ở mẫu N45 và N50 có xu hướng tăng trở lại nhưng sau khi xử lý anova, khơng có sự khác biệt giữa hai mẫu này.
C là mẫu cà phê xanh không xử lý enzyme; C0 là mẫu cùng điều kiện xử lý có nồng độ enzyme là
0IU/ml, nhiệt độ là 37oC; N30, N37, N45, N50 là các mẫu cà phê được xử lý enzyme có nồng độ là
3IU/ml ở nhiệt độlần lượt là 30, 37, 45, 50 độ C
Hình 3.6. Độ hấp thụ của acrylamide (a) và hàm lượng acrylamide (b) hình thành trong các
mẫu cà phê được xử lý với enzyme với các điều kiện nhiệt độ khác nhau
Sự giảm hàm lượng acrylamide thấp nhất ở nhiệt độ 37oC là do enzyme L- Asparaginase sử dụng có nguồn gốc từ Escherichia coli ATCC 11303, loại này có nhiệt độ tối ưu là 37oC, nghĩa là, ở mức nhiệt độ này, hoạt động của enzyme cho hiệu quả cao nhất
(Batool, và cộng sự. 2016). Khi nhiệt độ càng cao (45 và 50oC), enzyme hoạt động càng yếu. Enzyme chuyển hóa lượng asparagine ít, asparagine sẽ kết hợp với đường khử để tạo thành acrylamide dẫn đến hàm lượng acrylamide tạo thành tăng lên.
Như vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ là 37oC là thích hợp cho quá trình xử lý enzyme với cà phê. Nhiệt độ này cũng được sử dụng làm nhiệt độ tối ưu trong rất nhiều bài báo khác không chỉ với cà phê mà còn với nhiều sản phẩm tương tự (Hendriksen, 2009), (Anese, 2010), (Boegl và cộng sự, 2006), (Fei Xu và cộng sự, 2016). Giá trị nhiệt độ này sẽ được sử
dụng trong các khảo sát tiếp theo để đưa ra quy trình thích hợp làm giảm hàm lượng acrylamide tạo thành trong sản phẩm cà phê rang.
3.4.3. Ảnh hưởng của pH trong quá trình xử lý L-Asparaginase đến hàm lượng acrylamide tạo thành trong cà phê acrylamide tạo thành trong cà phê
Độ hấp thụ acrylamide và hàm lượng acrylamide hình thành trong các mẫu cà phê được xử lý bằng L – Asparaginase với các điều kiện pH khác nhau được trình bày ở hình 3.7. 0.25 0.35 0.45 0.55 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 A bs Bước sóng (nm) C C0 N30 N37 N45 N50 a 1200 1400 1600 1800 2000 2200 C C0 N30 N37 N45 N50 H àm lượng a cr yla m ide (µg /k g) Mẫu b
49
C là mẫu cà phê xanh khơng xử lý enzyme; C0 là mẫu cùng điều kiện xử lý có nồng độ enzyme là 0IU/ml; P5, P6, P7.3, P8.6 là các mẫu cà phê được xử lý enzyme có nồng độ là 3IU/ml tại pH lần
lượt là 5, 6, 7.3 và 8.6.
Hình 3.7. Độ hấp thụ của acrylamide (a) và hàm lượng acrylamide hình thành (b) trong các
mẫu cà phê được xử lý với enzyme với các điều kiện pH khác nhau
Kết quả phân tích hình 3.7 cho thấy ở các điều kiện pH khác nhau, độ hấp thụ và hàm lượng acrylamide tạo thành sẽ khác nhau. Mẫu cà phê xanh (C) có độ hấp thụ acrylamide cao nhất (0.54) và thấp nhất là 0.40 ở mẫu có pH là 7.3 (P7.3). Sau khi xử lý anova (phụ lục 2.3), mẫu ở pH 7.3 có sự khác biệt với các mẫu cịn lại. Hàm lượng acrylamide tạo thành trong mẫu P7.3 là 1694.03 µg/kg, giảm 16.46% so với mẫu cà phê xanh. Tuy nhiên, ở mẫu P8.6 hàm lượng acrylamide tạo thành có xu hướng tăng lên trở lại. Điều này có thể hiểu rằng, khi pH < 7.3 (nghĩa là ở pH5 và pH6), enzyme vẫn hoạt động được, vẫn cho hiệu quả làm giảm hàm lượng acrylamide, nhưng không giảm đến mức thấp nhất như ở pH7.3. Khi điều kiện pH ở ngưỡng 8.6, thì hàm lượng acrylamide tạo thành tăng lên. Nguyên nhân là do ở điều kiện môi trường pH này gây ức chế hoạt động của enzyme, enzyme trở nên bất hoạt và không thực hiện nhiệm vụ cản trở con đường tạo thành acrylamide được nữa dẫn đến hàm lượng acrylamide tạo thành tăng.
Theo một số khảo sát hầu hết L - Asparaginase khá đặc hiệu cho asparagine, tối ưu hoạt động thường đạt ở pH 5 -7. Hiệu quả hàm lượng acrylamide trong cà phê giảm từ 55- 74% đối với mẫu không xử lý (Xu, F., và cộng sự. 2016). L-Asparaginase được phân lập từ
Escherichia coli bằng phương pháp sắc ký cột diethylaminoethyl cellulose, hoạt động tối ưu
ở pH 7.5 - 8.6, phản ứng xúc tác thủy phân asparagine thành aspartic acid và giải phóng NH3 với hiệu suất 90% bằng L - Asparaginase (Roberts, J. và cộng sự, 1966). Đối với mỗi loại enzyme có nguồn khác nhau thì các đặc điểm tối ưu cũng khác nhau, khoảng pH tối ưu cho
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 A bs Bước sóng (nm) C C0 P5 P6 P7.3 P8.6 1200 1400 1600 1800 2000 2200 C C0 P5 P6 P7.3 P8.6 Hàm lượ ng a c ry la m id e (m ic ro g/ k g) Mẫu
50
asparaginase có nguồn gốc từ Escherichia coli trong khoảng 7-8 (Jha, S. K., và cộng sự. 2012).
Như vậy từ các phân tích bên trên, chúng tơi chọn pH 7.3 là thích hợp nhất cho quá trình xử lý cà phê rang xay bằng L – Asparaginase sử dụng sóng siêu âm. Giá trị pH này sẽ được sử dụng trong các khảo sát tiếp theo để đưa ra quy trình thích hợp nhằm làm giảm hàm lượng acrylamide tạo thành trong sản phẩm cà phê.
3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý cà phê với L-Asparaginase đến sự tạo thành acrylamide trong sản phẩm acrylamide trong sản phẩm
Độ hấp thụ acrylamide và hàm lượng acrylamide tạo thành trong các mẫu cà phê được xử lý bằng L – Asparaginase với các thời gian xử lý enzyme khác nhau được trình bày ở hình 3.8.
C là mẫu cà phê xanh không xử lý enzyme; C0 là mẫu cùng điều kiện xử lý có nồng độ enzyme là 0IU/ml và thời gian xử lý enzyme là 40 phút; T20, T30, T40, T50, T60 là các mẫu cà phê được xử
lý enzyme có nồng độ là 3IU/ml trong thời gian lần lượt là 20, 30, 40, 50, 60 phút Hình 3.8. Độ hấp thụ của acrylamide (a) và hàm lượng acrylamide hình thành (b) trong
các mẫu cà phê được xử lý với enzyme với các khoảng thời gian xử lý khác nhau
Kết quả phân tích ở hình 3.8 thể hiện độ hấp thụ acrylamide càng cao thì hàm lượng acrylamide tạo thành trong cà phê càng lớn và độ hấp thụ này có đỉnh ở bước sóng 224nm. Hình 3.8 (a) cho thấy mẫu cà phê xanh (mẫu C) khi chưa xử lý enzyme có độ hấp thụ acrylamide cao nhất (0.54) có nghĩa là hàm lượng acrylamide tạo thành trong mẫu cà phê này là nhiều nhất. Khi tăng thời gian xử lý enzyme từ 20 đến 60 phút, độ hấp thu acrymide có xu hướng giảm, và giảm thấp nhất (0.46) ở mẫu cà phê được xử lý trong 40 phút (T40).
Hàm lượng acrylamide hình thành trong các mẫu cà phê được thể hiện ở hình 3.8 (b). Mẫu có hàm lượng acylamide tạo thành cao nhất là mẫu C (2027.87 µg/kg). Mẫu C0 có nồng
0.25 0.35 0.45 0.55 210 220 230 240 250 A bs Bước sóng (nm) C C0 T20 T30 T40 T50 T60 a 1400 1600 1800 2000 2200 C C0 T20 T30 T40 T50 T60 Hàm lượng ac ry lamide (micr o g /kg) Mẫu b
51
độ enzyme là 0IU/ml cùng điều kiện pH và nhiệt độ giống với các mẫu cịn lại, sau đó tiến hành ngâm có kết hợp đánh sóng siêu âm trong 40 phút, cho kết quả hàm lượng acrylamide giảm. Độ giảm này khi xử lý anova khơng có sự khác biệt đáng kể so với mẫu cà phê xanh. Khi xử lý enzyme ở các mẫu cà phê còn lại (T20, T30, T40, M50, T60) trong các thời gian tương ứng từ 20 đến 60 phút, chúng tôi nhận thấy rằng, hàm lượng acrylamide có xu hướng giảm rõ rệt khi tăng thời gian xử lý. Lượng acrylamide ở mẫu T40 giảm mức thấp nhất là 1690.76 µg/kg (giảm đến 16.62% so với mẫu cà phê xanh).
Sau đó, khi càng tăng thời gian xử lý enzyme, lượng acrylamide tạo thành khơng cịn giảm nữa mà có xu hướng tăng nhẹ, nhưng khơng đáng kể (phụ lục 2.4). Điều này được lý giải trong báo cáo của David và cộng sự, (2004), ông cho rằng, khi thời gian xử lý càng lâu, enzyme càng có đủ thời gian để chuyển hóa thì lượng asparagine giảm càng lớn và do đó, hàm lượng acrylamide tạo thành giảm càng nhiều. Tuy nhiên, đến một thời điểm nào đó, lượng enzyme cạn kiệt, dẫn đến hàm lượng acrylamide tạo thành không giảm nữa.
Kết quả này cịn có thể được giải thích là q trình thẩm thấu enzyme vào hạt cà phê diễn ra một cách từ từ. Có thể dự đốn từ thời điểm phút thứ 30 trở đi thì sự thẩm thấu bên trong diễn ra hoàn toàn. Nên tác dụng của enzyme đến sự giảm acrylamide trong cà phê khơng có gì thay đổi trong khoảng thời gian này. Trong quá trình tổng quan tài liệu, chúng tơi khơng tìm thấy thơng tin nào đề cập đến sự ảnh hưởng của thời gian đến quá trình xử lý enzyme đối với cà phê. Tuy nhiên, ở nghiên cứu của Zuzana C. và cộng sự, (2006) về tác động của L-Asparaginase trên sản phẩm khoai tây, báo cáo chỉ ra rằng, trong thời gian xử lý enzyme 30 phút, hàm lượng acrylamide giảm đến 97%. Còn sự tác động của asparaginase đối với bánh quy, Monica A. và cộng sự, (2011) nói rằng tùy từng nồng độ enzyme, thời gian xử lý enzyme thường dao động trong khoảng từ 10 – 30 phút.
Như vậy từ các phân tích bên trên, chúng tơi chọn thời gian 30 phút là thích hợp nhất cho quá trình xử lý cà phê rang xay bằng L – Asparaginase sử dụng sóng siêu âm. Giá trị thời gian này được sử dụng cho các khảo sát sau này.
Tóm lại, q trình xử lý cà phê được thực hiện với chế độ phù hợp nhất là – nồng độ