Cách tiến hành:
Chuẩn bị hóa chất:
Thuốc thử DNS bao gồm: Nước cất: 60 – 70mL; NaOH rắn: 1,6g; DNS (C7H4N2O7): 1g; Muối natrikali tartrat (KNaC4H4O4.4H2O): 30g.
Khuấy tan hoàn toàn hỗn hợp bằng máy khuấy từ và định mực đến vạch 100mL bằng bình định mức. Thuốc thử được bảo quan trong điều kiện nhiệt độ thấp 2 – 8oC và không ánh sáng (dung dịch dùng tốt trong khoảng 10 – 15 ngày sau khi pha). Dung dịch glucose chuẩn 0.1%. Nước cất.
Chuẩn bị dịch trích ly đường từ cà phê: Mẫu cà phê được nghiền thành bột mịn. Cân 1g mẫu, gói gọn trong giấy lọc và thực hiện trích ly béo bằng phương pháp soxhlet (xem ở mục 2.6.1.3) để giảm hàm lượng chất béo có trong mẫu. Sau q trình trích ly chất béo đem mẫu sấy khô đến khối lượng khơng đổi, đem mẫu trích ly bằng cồn 80o có khuấy từ gia nhiệt khoảng 70-80oC bằng thiết bị hồi lưu trong vịng 2h, sau đó lọc dịch bằng giấy lọc để thu được hết dịch đường. Sau đó đuổi hết cồn bằng trích ly cơ quay dịch mẫu với tốc độ 90 vịng/phút, nhiệt độ cơ quay là 50oC trong khoảng 3 phút, thu dịch trích, xác định thể tích và đo UV-Vis bước sóng 540nm. Tiến hành pha loãng mẫu sao cho độ hấp thụ nằm trong khoảng thích hợp. Đây là dung dịch có thể tạo phức để đo độ hấp thụ.
Tiến hành phản ứng và dựng đường chuẩn glucose
Sử dụng dung dịch glucose chuẩn 0.1%, mẫu và thuốc thử để chuẩn bị dãy ống nghiệm có thành phần như Bảng 2.2. Sau đó, chúng ta tiến hành các bước sau:
36
- Đun sôi cách thủy các ống nghiệm đã được chuẩn bị theo công thức ở Bảng 2.2 trong 5 phút; sau đó, làm nguội nhanh các ống nghiệm đến nhiệt độ phòng.
- Lấy khoảng 2-3 mL mẫu trong ống nghiệm cho vào Cuvet; sau đó, đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm bằng thiết bị quang phổ so màu.
- Dựa vào số liệu thu được, vẽ đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ đường khử và độ hấp thu xác định được bằng thiết bị quang phổ so màu.
- Viết phương trình đường chuẩn: A = f(C), xác định hệ số tương quang R.
Bảng 2.2. Thành phần dãy ống nghiệm trong phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử
DNS
STT ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Dung dịch chuẩn, mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0 0 Dung dịch mẫu, mL 0 0 0 0 0 0 0.3 0.3 0.3 Nước cất, mL 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2 2.7 2.7 2.7 Thuốc thử DNS, mL 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OD540nm Hàm lượng (mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 - - - Tính tốn kết quả:
Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được X mg/ml đường khử trong dung dịch đường pha lõang.
Nhân với hệ số pha loãng n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc. Chọn hệ số pha lõang n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn. Tính hàm lượng đường khử trong nguyên liệu (mg/g) = X∗n∗V
𝑚 (2.6)
V: thể tích dịch đường gốc (ml); m: khối lượng mẫu cân (g); n: là độ pha loãng mẫu.
2.6.1.6. Xác định hàm lượng acrylamide trong mẫu cà phê
Mục đích: Xây dựng đường chuẩn để xác định hàm lượng acrylamide ở mẫu phân tích. Cách tiến hành: Sự thay đổi của mật độ quang (OD) tới nồng độ của acrylamide được
xác định bằng phương pháp quang phổ dựa theo nghiên cứu của Palanti S. và cộng sự, 2015 với một vài thay đổi.
Cân một lượng 1mg acrylamide tinh khiết vào (1) 1000ml và sau đó định mức lên đúng thể tích với nước cất. Dùng pipette lấy ra 0.5ml chuyển vào bình định mức (2) 100ml, dùng NaOH 1M thêm vào lên đúng thể tích thu được dung dịch acrylamide với nồng độ 5 ng/ml (dung dịch gốc chuẩn A). Từ dung dịch gốc chuẩn A chuẩn bị dãy ống nghiệm với
37
các nồng độ acrylamide lần lượt là 0, 0.25; 0.5; 0.75; 1.00; 1.25; 1.50, 1.75; 2.00; 2.25; 2.50 ng/ml (bảng 2.3). Sau đó dãy dung dịch này được quét bằng máy quang phổ UV-Vis UH5300 ở dải bước sóng từ 210 – 250nm.
Bảng 2.3. Thành phần dãy ống nghiệm dùng để xây dựng đường chuẩn acrylamide
ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dd acrylamide (5 ng/ml), ml 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 NaOH 1N, ml 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Nước cất, ml 1 0.95 0.9 0.85 0.8 0.75 0.7 0.65 0.6 0.55 0.5 Hàm lượng, ng/ml 0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 OD 210 – 250nm
- Xử lý mẫu cà phê xác định hàm lượng acrylamide
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp xử lý mẫu dựa trên nghiên cứu của Dange V. U. và cộng sự, 2018 với một số hiệu chỉnh.
Các mẫu cà phê sau khi được xử lý hoặc chưa xử lý với enzyme L-Asparaginase ở những điều kiện khác nhau được nghiền thành bột mịn. Mỗi mẫu được đồng nhất hóa với việc thêm nước (tỷ lệ mẫu : nước là 1:20) và khuấy trong vòng 20 phút.
Các mẫu đã đồng nhất được đem đi ly tâm ở tốc độ 4000 rpm trong vòng 20 phút. Thu lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc 20µm và xác định thể tích của dịch trích Dange V. U. và
cộng sự, 2018. Tiến hành pha loãng mẫu sao cho độ hấp thụ nằm trong khoảng thích hợp.
Đo độ hấp thụ acrylamide
Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng tối đa nhận được ở trên là 224 nm (Zhan, K., và
cộng sự, 2014) và sử dụng mẫu trắng theo phương pháp xây dựng đường chuẩn acrylamide.
2.6.1.7. Xác định hàm lượng asparagine trong mẫu cà phê
Cân 10mg asparagine tinh khiết chuyển vào bình định mức (1) 100ml và sau đó định mức lên đúng thể tích bằng dung dịch HCL 1N. Dùng pipette lấy ra 2.5 ml chuyển vào bình định mức (2) 100ml, dùng HCl 1N thêm vào lên đúng thể tích thu được dung dịch asparagine với hàm lượng 2.5 µg/ml (dung dịch gốc chuẩn A).
Từ dung dịch gốc chuẩn A chuẩn bị dãy ống nghiệm với các hàm lượng asparagine lần lượt là 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5 µg/ml (bảng 2.4). Sau đó dãy dung dịch này được quét bằng máy quang phổ UV-Vis UH5300 ở dải bước sóng từ 190-240nm, sử dụng dung dịch HCl 1N làm mẫu đối chứng (blank).
38
Bảng 2.1. Thành phần ống nghiệm dùng để xây dựng đường chuẩn asparagine
Thành phần Blank 1 2 3 4 5 6
Dung dịch asparagine 2.5 µg/ml (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Dung dịch HCl 1N (ml) 5 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4
Tổng thể tích (ml) 5 5 5 5 5 5 5
Hàm lượng asparagine (µg/ml) 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5
- Xử lý mẫu cà phê xác định hàm lượng asparagine
Các mẫu cà phê sau khi được xử lý hoặc chưa xử lý với enzyme L-Asparaginase ở những điều kiện khác nhau được nghiền thành bột mịn. Mỗi mẫu được đồng nhất với việc thêm HCl 1N (tỷ lệ mẫu : HCl là 1:20) bịt kín miệng và khuấy từ trong vịng 12h, gia nhiệt ở khoảng 60 -70oC bằng glycerol.
Các mẫu sau khi đồng nhất xong thì tiến hành lọc qua giấy lọc 20µm và xác định thể tích. Tiến hành pha lỗng mẫu sao cho độ hấp thụ nằm trong khoảng thích hợp.
- Đo độ hấp thụ asparagine
Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng tối đa nhận được ở trên là 208 nm và sử dụng mẫu trắng theo phương pháp xây dựng đường chuẩn asparagine.
2.6.2. Phương pháp so màu với hệ màu CIE LAB
Cách thực hiện: Việc xác định màu được thực hiện ở trên các vị trí khác nhau của cà phê đã nghiền mịn (Pinho và cộng sự, 2004). Các phép đo màu xác định theo không gian màu CIELAB (Youssef và cộng sự, 2015).
Trong đó:
L: giá trị đại diện cho màu từ đen (0) đến trắng (100). a: giá trị đại diện cho màu từ đỏ (+) đến xanh lục (-). b: giá trị đại diện cho màu vàng (+) đến màu xanh (-).
ΔE là mức độ chênh lệch màu giữa các mẫu (Pathare et al, 2012) được tính bằng cơng thức sau (Pathare et al, 2012; Mokrzycki et al, 2011; Huang et al, 1970):
∆𝐸∗ = √(∆𝐿)2 + (∆𝑎)2+ (∆𝑏)2) (2.6)
Dựa vào giá trị △E, có 4 trường hợp, nếu (Adekunt et al, 2010): 0 <△E*<1: Người quan sát không nhận thấy sự khác biệt về màu sắc;
1 <△E*<2: Chỉ những người quan sát có kinh nghiệm có thể nhận thấy sự khác biệt về màu sắc;
2 <△E*<3,5: Những người quan sát chưa có kinh nghiệm cũng có thể nhận thấy sự khác biệt về màu sắc;
39