CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.4. Xột nghiệm húa sinh
Cỏc xột nghiệm về chuyển húa sắt như Ferritin, sắt huyết thanh, SGOT, SGPT, Ure, Creatinin tại Khoa húa sinh, Bệnh viện Nhi trung ương.
2.2.5. Phỏt hiện và phõn tớch đột biến gen β-globin
42
Khoa sinh học phõn tử, Bệnh viện Nhi trung ương. Quy trỡnh phỏt hiện đột biến gen ở đõy đó được cụng nhận chất lượng BOA (Bureau of Accreditation), cấp chứng chỉ đạt tiờu chuẩn ISO 15189 : 2012.
- Thu thập mẫu mỏu và tỏch DNA từ mỏu ngoại biờn bệnh nhõn. Lấy 2ml mỏu ngoại biờn từ tĩnh mạch, vụ khuẩn và chống đụng bằng EDTA 1,5mg/ml.
- Tỏch DNA tổng số từ mỏu ngoại vi, sử dụng bộ kớt tỏch DNA thương mại QIA gen DNA blood miniket của Đức. DNA tổng số sau khi tỏch chiết được đo nồng độ và độ tinh sạch bằng mỏy Nano drop (Thermo). Nồng độ DNA tổng số > 30ng, độ tinh sạch 260/280 = 1,7 – 1,9.
- Kỹ thuật PCR phỏt hiện đột biến gen β-globin:
Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR là cỏc kỹ thuật được thiết lập để xỏc định cỏc đột biến điểm gen β-globin. Cho đến nay đó phỏt hiện trờn 200 đột biến gen β-globin, bao gồm đột biến tỏc động đến từng bước phiờn mó gen HBB
(transcription of β-globin gene), tiến trỡnh hồn thiện RNA (RNA processing) và dịch mó RNA (RNA translation). Hầu hết đột biến gen HBB là đột biến điểm. Chỳng tụi chọn 9 đột biến điểm thường gặp ở khu vực Đụng Nam Á [112] để phỏt hiện sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR; đú là CD41/42 (- TCTT), CD17 (AAG→TAG), IVS 1-1 (G-T), -28 (A→G), IVS2.654 (C-T), CD71/72 (+A), IVS 1-5 (G-C), CD95 (+A) và HbE – CD26 (AAG – GAG).
9 đột biến này được chia thành 3 bước sàng lọc đồng thời.
Bước 1: Sàng lọc 4 đột biến CD41/42 (-TCTT), CD17 (AAG – TAG), IVS 1-1 (G-T) và -28 (A – G)
Bước 2: Sàng lọc 4 đột biến IVS 2- 654 (C – T), CD71/72 (+A), IVS 1-5 (G - C) và CD 95 (+A).
Bước 3: Sàng lọc đột biến HbE (AAG – GAG) – CD26.
Cỏc đột biến được phỏt hiện qua Multiplex ARMS –PCR, kiểu gen được xỏc định bằng ARMS –PCR. Đột biến CD26 của HbE được phỏt hiện trực tiếp bằng ARMS –PCR, nếu thấy cú HbE trờn điện di Hb.
43
- Điện di DNA trờn gel agarose 1% với dũng điện một chiều, điện thế 100v, cường độ dũng điện 60 – 80 mA, quan sỏt sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue cú trong đệm tra mẫu để ngừng chụp với thời gian thớch hợp.
Sau đú nhuộm DNA bằng EtBr (nồng độ 1àg/ml) trong thời gian 20 phỳt trờn mỏy lắc nhẹ. Quan sỏt và chụp ảnh Gel, dưới ỏnh sỏng cực tớm UV ở bước súng 320 nm, sản phẩm DNA sẽ quan sỏt thấy dạng cỏc vết sỏng
Hỡnh 2.1. Sản phẩm DNA điện di trờn gel agarose (mang 1 đột biến gen CD41/42) (mang 1 đột biến gen CD41/42)
Được làm tại khoa di truyền phõn tử Bệnh viện nhi Trung ương
M: Marker 100bp H2O: Mẫu nước khụng chứa DNA ĐC (-): Mẫu chứng khụng cú đột biến BT: Bỡnh thường
ĐC (+): Mẫu chứng cú đột biến ĐB: Đột biến BN: Mẫu bệnh nhõn
- Kỹ thuật giải trỡnh tự gen, xỏc định đột biến gen β-globin:
Kỹ thuật này được tiến hành với cỏc mẫu khụng phỏt hiện được đột biến gen bằng kỹ thuật Multiplex – PCR và ARMS – PCR ( hỡnh 2.1.). Quy trỡnh thực hiện gồm 3 phản ứng PCR khuếch đại trỡnh tự đoạn gen β-globin 1 (exon 1,2, một phần intron 2), đoạn gen β-globin 2 (intron 2), đoạn gen β-globin 3 (một phần
M ĐC (-) BT ĐB ĐC (+) BT ĐB BN (1) BT ĐB BN (2) BT ĐB H2O BT ĐB 439bp
44
Phõn tớch dữ liệu thu được, so sỏnh với trỡnh tự nucleotide và axit amin tham khảo của ngõn hàng Gene Bank.
- Kỹ thuật GAP PCR: Là kỹ thuật sử dụng một mồi xuụi, một mồi ngược gắn ở hai bờn ranh giới của cựng DNA đứt góy, mục đớch để phỏt hiện đột biến mất đoạn toàn bộ gen β-globin.
- Quy trỡnh phỏt hiện đột biến gen HBB được trỡnh bày trong sơ đồ sau:
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ quy trỡnh phỏt hiện đột biến gen β-globin