1.3.2. Sử dụng enzym cắt giới hạn
Xác định đột biến bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn là phương pháp gián tiếp, tại các vị trí có điểm cắt của enzym. Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, chính xác, giá thành rẻ, ít phức tạp. Nhược điểm là khơng phát hiện được tồn diện các đột biến trên gen mà chỉ xác định được đột biến tại vị trí đ biết trước và thường là các đột biến phổ biến. Kỹ thuật này ít được sử dụng để phát hiện đột biến gen ATP7B do đột biến trên gen ATP7B ít tập trung tại một vị trí mà nằm rải rác khắp chiều dài gen.
Hình 1.13: Hình ảnh minh họa xác định đột biến R778W trên gen ATP7B bằng kỹ thuậtcắt enzym giới hạn.. Mr: Marker100bp. M: mẹ bệnh nhân; F:
bố bệnh nhân; S: chị gái bệnh nhân; WD: bệnh nhân. Nếu bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử R778W thì sản phẩm 256 bp sẽ khơng bị cắt và chỉ có 1 vạch, trong trường hợp đột biến dị hợp tử, 1 alen sẽ bị cắt và sản phẩm PCR
sẽ có 3 vạch 256 bp, 216 bp và 29 bp, nếu khơng có đột biến sản phẩm PCR sẽ bị cắt thành 2 sản phẩm với kích thước 216 bp và 29 bp [74].
Năm 2010, Đỗ Thanh Hương và cộng sự đ sử dụng phương pháp này để xác địnhđột biến gen Arg778Leu ở bệnh nhân Wilson Việt Nam [5].
1.3.3. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing)
Do phần lớn các đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson là đột biến điểm và thường nằm rải rác khắp chiều dài của gen nên phương pháp giải trình tự
gen ATP7B vẫn được coi là một tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biến gen gây bệnh.
Giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng
dideoxynucleotid (ddNTP) do Sanger và CS phát minh. Với các máy thế hệ sau này, 4 màu huỳnh quang khác nhau được dùng để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ng nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng chứ không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây. Đ i với phương pháp giải trình tự tự động, hệ th ng điện di thường sử dụng là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cu i cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng và sẽ được máy ghi nhận rồi chuyển về máy tính phân tích. Máy phân
tích sẽ nhận diện được các nucleotid tương ứng với mỗi màu huỳnh quang khác nhau từ đó biết được trình tự của DNA đích. Trình tự gen được đ i chiếu và so sánh với trình tự gen trên Genebank (National Center for Biotechnology
Information - NCBI) để phát hiện đột biến.