Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.6. Nghiờn cứu húa mụ miễn dịch
2.2.6.1. Kỹ thuật húa mụ miễn dịch
- Phương phỏp nhuộm:
+ Nhuộm HMMD dịch theo phương phỏp phức hợp Avidin Biotin tiờu chuẩn (Standard Avidin Biotin Complex Method).
+ Kỹ thuật HMMD được thực hiện trờn mụ đỳc khối nến với cỏc dấu ấn HMMD như sau:
* 495 ca: ER, PR, Her-2/neu, Ki67, p53, Bcl2, D2-40 * 103 ca bộ ba õm tớnh: p63, EGFR, CK5/6, CK17 * 293 ca thụ thể nội tiết dương tớnh: CK18
TT Dấu ấn Clone Hóng SX Pha loóng Cỏch bắt màu
1. ER PGP-1A6 Ventana Pha sẵn Nhõn
2. PR 6F11 Ventana Pha sẵn Nhõn
3. HER2 4B5 Ventana Pha sẵn Màng bào tương
4. Ki67 MIB-5 Dako 1/150 Nhõn
5. p53 DO-7 Dako 1/50 Nhõn
6. p63 DAK-p63 Dako 1/50 Nhõn
7. EGFR E30 Dako 1/50 Màng bào tương
8. CK5/6 D5/16 B4 Dako 1/100 Bào tương
9. CK17 E3 Dako 1/40 Màng /bào tương
10. CK18 EP17+EP30 Dako 1/50 Màng / bào tương
11. Bcl2 124 Dako 1/100 Bào tương
12. D2-40 D2-40 Ventana 1/200 Bào tương
+ Quy trỡnh nhuộm tiờu bản HMMD: cỏc tiờu bản được nhuộm HMMD bằng mỏy của hóng Ventana hoặc Dako.
Chuẩn bị tiờu bản:
* Mẫu mụ phải được cố định 6-48 giờ trong formalin trung tớnh 10%. * Dựng tiờu bản Super Frosted, tăng độ bỏm dớnh của mụ nờn trong quỏ trỡnh nhuộm mẫu mụ khụng bị trụi.
* Làm khụ tiờu bản và chắc chắn là mẫu mụ được loại hết nước. * Sấy tiờu bản ở 56oC ớt nhất 30 phỳt trước khi nhuộm.
Vật liệu dựng trong quy trỡnh:
* Tiờu bản Super Frosted của hóng Thermo. * Xylene, cồn 70%, cồn tuyệt đối.
* Nước khử ion húa. * Nhón mó vạch.
* Bộ kớt phỏt hiện Ventana UltraView Universal DAB. * Dung dịch Ventana Cover Slip .
* Ventana Reaction Buffer. * Ventana Hematoxylin II. * Ventana Bluing reagent. * Mounting Medium. * Lamella.
Nhuộm tiờu bản:
Khử nến Chọn
Bộc lộ khỏng nguyờn Cell Conditioning 1, 30 phỳt
Enzyme (Protease) Khụng
Khỏng thể thứ nhất 24 phỳt, 37oC
UltraWash Khụng
Nhuộm tương phản Khụng
Sau nhuộm tương phản Khụng
Cỏc bước sau nhuộm:
* Rửa tiờu bản vớixà phũng 30 giõy để loại bỏ dung dịch Cover Slip. * Rửa tiờu bản vớinước khử ion để chắc chắn loại hết xà phũng. * Rửa tiờu bản vớiEthanol 70%, sau đú Ethanol 100%, loại nước. * Rửa tiờu bản với Xylene.
* Để khụ tiờu bản trong khụng khớ. * Dỏn lamella.
2.2.6.2. Đỏnh giỏ kết quả HMMD
- ER, PR
Đỏnh giỏ kết quả theo tiờu chuẩn của Allred và nhà sản xuất Dako dựa vào tỷ lệcỏc tế bào dương tớnh và cường độ bắt màu của tế bào u như sau:
Hỡnh 2.1: Tiờu chuẩn đỏnh giỏ mức độ biểu hiện của ER và PR
Tớnh điểm dựa vào phương phỏp H-score cải biờn = TL(%) x CĐ (từ 0 đến 300 điểm). Phản ứng dương tớnh khi tổng điểm >10.
- HER2 (C-erb-2)
Đỏnh giỏ kết quả: Theo tiờu chuẩn của nhà sản xuất, được chia từ 0 đến 3+: 0: Hoàn toàn khụng bắt màu.
1+: Khụng nhỡn thấy hoặc nhuộm màng bào tương dưới 10% tế bào u. 2+: Màng bào tương bắt màu từ yếu đến trung bỡnh ở >10% tế bào u. 3+: Màng bào tương bắt màu toàn bộ với cường độ mạnh được quan sỏt thấy trờn 10% cỏc tế bào u. Chỉ 3+ mới được coi là dương tớnh.
- Ki-67
Ki67 dương tớnh khi cú bất kỳ nhõn tế bào u bắt màu. Theo hội nghị đồng thuận tại Saint Gallen năm 2011, chỉ số K67 được chia thành 3 mức độ: thấp (≤15%), trung bỡnh (16-30%) và cao (>30%) [20].
- p53 và p63
Nhuộm nhõn tế bào u được chia điểm từ 0 đến 3 [87]: 0: Hoàn toàn khụng bắt màu
1: <1/10 nhõn tế bào u bắt màu 2: 1/10-1/2 nhõn tế bào u bắt màu 3: >1/2 nhõn tế bào bắt màu Dương tớnh khi từ 1 điểmtrở lờn
- CK5/6, CK17, CK18 và EGFR
Mọi tế bào u xõm nhập cú bào tương và/ màng bào tương nhuộm màu vàng nõu (yếu hoặc mạnh) được coi là dương tớnh [14, 88].
- Bcl2
+ 0: Âm tớnh
+ 1+: Bắt màu yếu <10% tế bào u
+ 2+: Bắt màu trung bỡnh ≥ 10% - 75% tế bào u + 3+: Bắt màu mạnh > 75% tế bào u
Đỏnh giỏ Bcl2: dương tớnh (2+/3+) [89].
- D2-40
D2-40(+) nếu màng bất kỳ tế bào nội mụ bạch mạch bắt màu vàng nõu.
2.2.6.3. Kiểm chứng dương và kiểm chứng õm
- Kiểm chứng dương:
+ ER, PR, CK5/6, CK17, CK18, p63: Biểu mụ tuyến vỳ lành. + Bcl2: Mụ lympho lành.
+ HER2, p53, D2-40 và Ki-67: Sử dụng một tiờu bản đó chắc chắn là dương tớnh làm chứng dương.
- Kiểm chứng õm: Khụng phủ khỏng thể thứ nhất vào tiờu bản đối với tất cả cỏc trường hợp nhuộm tiờu bản chứng õm.