Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.7. Phương phỏp FISH
96 khối u nhuộm HMMD cú HER2(2+) sẽ được đỏnh giỏ sự khuếch đại gen HER2 bằng phương phỏp FISH, tựy theo kết quả FISH, cỏc khối ung thư vỳ sẽ được xếp vào cỏc typ phõn tử tương ứng.
Phương phỏp FISH được sử dụng xột nghiệm Path Vysion vỡ trong sản phẩm cú 2 loại đoạn dũ, phỏt hiện được cả gen HER2 và nhiễm sắc thể 17.
- Quy trỡnh lai: gồm cỏc bước sau + Chuẩn bị mẫu
* Mẫu mụ được cố định 6-48 giờ trong formalin trung tớnh 10%, vựi nến. * Mẫu mụ được cắt mỏng khoảng 4 m, gắn lờn tiờu bản đó được trỏm silan. * Tiờu bản được ủ qua đờm ở nhiệt độ 56oC.
+ Khử nến
* Đỏnh dấu vựng tế bào ung thư xõm nhập.
* Nhỳng tiờu bản vào xylene, 3 lần, mỗi lần 5 phỳt. * Khử nước bằng alcohol 100%, 2 lần, mỗi lần 5 phỳt. * Làm khụ tiờu bản ở 45oC, 2-5 phỳt.
+ Xử lý paraffin
* Nước cất 1 lần, 3 phỳt.
* Pretreatment Wash Buffer, 1 lần, 3 phỳt.
* Pretreatment Wash Buffer, nhiệt độ 80oC, 30 phỳt. * Nước cất 1 lần, 1 phỳt.
* Pretreatment Wash Buffer, nhiệt độ phũng, 2 lần, mỗi lần 5 phỳt.
+ Xử lý protease
* Tiờu bản được lau khụ cỏc vựng nước đọng.
* Dung dịch protease, 20 phỳt (10-60phỳt), nhiệt độ phũng. * Dung dịch Wash Buffer, 2 lần, 5 phỳt.
+ Khử nước
* Alcohol 70o, nhiệt độ phũng, 1 phỳt. * Alcohol 85o, nhiệt độ phũng, 1 phỳt. * Alcohol 100o, nhiệt độ phũng, 1 phỳt. * Làm khụ tiờu bản ở 45oC, 2-5 phỳt.
+ Tỏch DNA và lai đồng thời, dựng mỏy ThermoBrite
* Thực hiện cụng việc trong buồng tối. * Làm ấm lọ chứa đoạn dũ bằng mỏy lắc.
* Nhỏ 5 l đoạn dũ lờn vựng ung thư xõm nhập đó được đỏnh dấu. * Dỏn lamella, kớch thước 22x22.
* Kớch hoạt chương trỡnh:
Tỏch DNA 75oC, 5 phỳt.
Lai đoạn dũ và DNA đớch ở nhiệt độ 37oC, thời gian lai là 18 giờ. * Tạo mụi trường ẩm, khởi động chương trỡnh tỏch DNA và lai với đoạn dũ.
+ Rửa sau khi lai
* Thực hiện cụng việc trong buồng tối.
* Làm núng dung dịch rửa lai (2XSSC0,3% NP-40, pH7-7,5) ở 72oC. * Chuẩn bị một lọ dung dịch rửa sau lai ở nhiệt độ phũng.
* Nhỳng tiờu bản vào dung dịch sau lai ở nhiệt độ phũng, lắc nhẹ để lamella rời ra.
* Lau nước đọng trờn tiờu bản.
* Nhỳng tiờu bản vào dung dịch lai ở 72oC, 2 phỳt. * Làm khụ tiờu bản trong buồng tối.
+ Nhuộm màu tương phản
* Thực hiện cụng việc trong buồng tối.
* Nhỏ 5 l DAPI vào vựng đó chọn (nhuộm tương phản nhõn). * Dỏn lamella.
* Lưu trữ tiờu bản vào hộp cú bọc giấy bạc.
* Lưu trữ tiờu bản ở -20 oC, ớt nhất 30 phỳt trước khi đọc kết quả.
- Đỏnh giỏ kết quả: Kết quả được phõn tớch theo khuyến cỏo của ASCO/CAP 2007, đếm tớn hiệu HER2 và CEP17 trờn 20 nhõn tế bào u rời, ở vựng ung thư xõm nhập.
- Tỷ lệ HER2/CEP17 >2,2 khi sử dụng bộ kit PathVysion là khuếch đại. - Tỷ lệ HER2/CEP17 <1,8, hoặc cú ớt hơn 4 tớn hiệu ở mỗi nhõn, kết quả nhuộm FISH là khụng khuếch đại (theo Wolff, 2007).
- Tỷ lệ HER2/CEP17 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,2 hay cú trung bỡnh 4 – 6 tớn hiệu ở mỗi nhõn thỡ kết quả được xem là giỏp biờn. Trường hợp “giỏp biờn”, cần đếm thờm 20 tế bào khỏc và tớnh tỉ lệ lại. Nếu tỉ lệ vẫn nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 thỡ cần một người khỏc đọc và đếm lại. Sau đú tớnh trung bỡnh trờn 60 tế bào.