ƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
2.4.2. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật
2.4.2. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mậtnhân nhân 2.4.2.1. Phân lập các hợp chất hóa học a. Nhóm hợp chất alkaloid + Nhiệt độ: 70 oC + Thời gian: 120 phút + Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 20 mL/1 g
Hình 2.3. Sơ đồ chưng cất tạo cao chiết nước
Lọc
Cô quay chân khơng (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0C, số vịng quay: 40 vịng/phút
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất nhóm alkaloid
Tiến hành chưng ninh hồi lưu trong nước 4 kg bột rễ cây mật nhân ở nhiệt độ 70 oC trong 120 phút với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20 mL/g theo sơ đồ hình 2.3. Sau khi loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô quay chân không thu được 40 g cặn chiết nước. Cho 40 g cặn chiết nước qua hệ thống sắc ký cột với chất hấp phụ là Diaion đường kính cột d = 60 mm; chiều dài lớp Diaion l = 800 mm); hệ dung môi rửa giải 100% H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2); MeOH:H2O (5:5) và
Phân đoạn F8 và F9 được gộp lại ký hiệu F8 (1,7 g được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043 mm - 0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung mơi CH2Cl2:MeOH 98:2 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 19 phân đoạn, được ký hiệu là F8 1 đến F8 19 Phân đoạn F8 12 200 mg được tách qua sắc ký cột sephadex rửa giải bằng MeOH thu được 7 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F8.12.1 đến F8 12 7 Phân đoạn F8.12.3 sau hai lần được tách bằng sắc ký cột sephadex thu được 10 mg chất sạch rắn, màu trắng k hiệu là EL1B (chất 1) và 5 mg chất rắn màu trắng EL1C (chất 4).
Phân đoạn F3 và F7 được gộp lại ký hiệu F3 17 g và được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung mơi CH2Cl2:MeOH 9:1 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1 và cuối cùng rửa giải cột bằng hệ dung môi MeOH:H2O 1:1 , thu được 15 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F3.1 đến F3. 15.
Phân đoạn F3.2 (1.2 g được tách bằng sắc ký cột silicagel rửa giải bằng hệ dung mơi CH2Cl2:MeOH 95:5 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 14 phân đoạn ký hiệu từ F 3 2 1 đến F3.2.14.
Phân đoạn F3.2.12 (20 mg) sau hai lần qua cột Sephadex thu được 6 mg chất sạch dạng rắn màu vàng ký hiệu EL4 (chất 2). Phân đoạn F3.6 (0,12 g) tách bằng sắc ký cột silicagel hệ dung môi DCM:MeOH 95:5 thu được 4 phân đoạn Phân đoạn F3.6.2 được tách bằng sắc k thu được 4 mg chất sạch màu trắng ký hiệu EL5 (chất 3).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết nước của rễ cây mật nhân được mơ tả ở hình 2.3 và hình 2.4 [5].
b. Nhóm hợp chất khác
Hình 2.5. Sơ đồ tạo cao chiết n-henxane và cao chiết ethyl acetate
Chiết trong ethyl acetate
Rễ mật nhân
Bả Lọc
Ngâm chiết với ethanol 85 % trong 3 giờ
Cô quay chân khơng (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0C, số vịng quay: 40
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0C, số vịng quay: 40
Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các chất khơng thuộc nhóm alkaloid
Tiến hành chiết Soxhlet trong n-hexane 3 kg bột rễ cây mật nhân trong 7 lít dung mơi trong 24 giờ, dịch chiết được lọc, gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 4,1 g cặn. Phần bã được ngâm chiết với ethanol 85 % 3 kg bã được chiết trong 8 lít dung mơi trong 3 giờ), khuấy ở nhiệt độ 50 oC và tiếp tục để ngâm qua đêm Sau ba lần chiết, dịch chiết được lọc và quay cất dưới áp suất giảm đến thể tích khoảng 500 mL. Cho ethyl acetate vào, chiết phân lớp ba lần (mỗi lần 250 mL). Dịch chiết ethyl acetate được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 69,1 g cặn chiết ethyl acetate.
Cao chiết n-hexane 4,1 g được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH (9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn. Ở phân đoạn 6 thu được 6 mg một chất sạch màu vàng hình kim kết tinh được ký hiệu là MNH1 (chất 5).
Cao chiết ethyl acetate 35 g được phân tách bằng cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn ký hiệu từ PĐE 1 đến PĐE 92 Phân đoạn PĐE 25 có 20 mg chất sạch dạng bột màu trắng kết
tinh được đặt tên là MN.25.10 (chất 6 Phân đoạn PĐE 34 550 mg được chạy cột Rp với hệ dung môi rửa giải là MeOH:H2O (1:1) thu được 5 phân đoạn ký hiệu từ PĐE 34 1 đến PĐE 34 5 Phân đoạn PĐE 34 2 có 25 mg chất sạch dạng bột màu trắng kết tinh được đặt tên là MN.34.2 (chất 7).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết n-hexane và cao chiết ethyl acetate của rễ cây mật nhân được mơ tả ở hình 2.5 và hình 2.6 [7].
2.4.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được
Cấu trúc hóa học của các chất sạch được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương pháp vật lý (tonc, [α]D và các phương pháp phổ hiện đại như: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ khối ion hóa bằng bụi electron (ESI- MS), phổ khối có độ phân giải cao (HR-ESI-MS , phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H- NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) [27] [28].