CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
2.4.2. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật nhân
Bã
điều kiện thực hiện thuận lợi và gần đây có nhiều tác giả đã chọn phương pháp này [35]. Thí nghiệm được thực hiện tại phịng thí nghiệm của Trường đại học bách khoa – Đại học Đà Nẵng.
Từ kết quả nghiên cứu và sàng lọc, vùng nguyên liệu được lựa chọn để thu nhận rễ mật nhân nhằm thực hiện các công đoạn nghiên cứu tiếp theo.
2.4.2. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mậtnhân nhân 2.4.2.1. Phân lập các hợp chất hóa học a. Nhóm hợp chất alkaloid + Nhiệt độ: 70 oC + Thời gian: 120 phút + Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 20 mL/1 g
Hình 2.3. Sơ đồ chưng cất tạo cao chiết nước
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút
Cao chiết nước Lọc
Cao chiết nước (40 g) F8 (1,7 g) (F8 + F9) F3 (17 g)(F3 + F7) F8.1F8.19 chọn F8.12 (200 mg) F3.1F3.15 chọn F3.6 (0,12 g) F3.1F3.15 chọn F3.2 (1,2 g) F8.12.1F8.12.7 chọn F8.12.3 F3.6.1F3.6.4 chọn F3.6.2 F3.2.1F3.2.14chọn F3.2.12 EL1B (10 mg) (trắng) EL1C (5 mg) (trắng) EL5 (6 mg) (trắng) EL4 (6 mg) (vàng) SKC Sephadex (2 lần) SKC Sephadex SKC Sephadex (2 lần) SKC silicagel, hệ dung môi DCM:MeOH
95:5 , thu được 4 phân đoạn
SKC silicagel, hệ dung môi CH2Cl2:MeOH
95:5 tăng dần đến tỷ lệ 1:1 , thu được 14 phân đoạn SKC Sephadex, rửa giải bằng MeOH, thu được 7 phân đoạn
SKC silicagel, hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 9:1tăng dần đến 1:1), rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (1:1), thu được 15 nhóm phân đoạn SKC silicagel, hệ dung mơi CH2Cl2:MeOH
98:2 tăng dần đến 1:1), thu được 19 phân đoạn
SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải 100% H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2); MeOH:H2O (5:5) và MeOH 100%thu được 15 phân đoạn F1-F15)
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất nhóm alkaloid
Tiến hành chưng ninh hồi lưu trong nước 4 kg bột rễ cây mật nhân ở nhiệt độ 70 oC trong 120 phút với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20 mL/g theo sơ đồ hình 2.3. Sau khi loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô quay chân không thu được 40 g cặn chiết nước. Cho 40 g cặn chiết nước qua hệ thống sắc ký cột với chất hấp phụ là Diaion đường kính cột d = 60 mm; chiều dài lớp Diaion l = 800 mm); hệ dung môi rửa giải 100% H2O; MeOH:H2O (9:1); MeOH:H2O (8:2); MeOH:H2O (5:5) và
Phân đoạn F8 và F9 được gộp lại ký hiệu F8 (1,7 g được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043 mm - 0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 98:2 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 19 phân đoạn, được ký hiệu là F8 1 đến F8 19 Phân đoạn F8 12 200 mg được tách qua sắc ký cột sephadex rửa giải bằng MeOH thu được 7 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F8.12.1 đến F8 12 7 Phân đoạn F8.12.3 sau hai lần được tách bằng sắc ký cột sephadex thu được 10 mg chất sạch rắn, màu trắng k hiệu là EL1B (chất 1) và 5 mg chất rắn màu trắng EL1C (chất 4).
Phân đoạn F3 và F7 được gộp lại ký hiệu F3 17 g và được tách bằng sắc ký cột, chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm) rửa giải bằng hệ dung mơi CH2Cl2:MeOH 9:1 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1 và cuối cùng rửa giải cột bằng hệ dung môi MeOH:H2O 1:1 , thu được 15 nhóm phân đoạn ký hiệu từ F3.1 đến F3. 15.
Phân đoạn F3.2 (1.2 g được tách bằng sắc ký cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH 95:5 sau đó, tăng dần đến tỷ lệ 1:1, thu được 14 phân đoạn ký hiệu từ F 3 2 1 đến F3.2.14.
Phân đoạn F3.2.12 (20 mg) sau hai lần qua cột Sephadex thu được 6 mg chất sạch dạng rắn màu vàng ký hiệu EL4 (chất 2). Phân đoạn F3.6 (0,12 g) tách bằng sắc ký cột silicagel hệ dung môi DCM:MeOH 95:5 thu được 4 phân đoạn Phân đoạn F3.6.2 được tách bằng sắc k thu được 4 mg chất sạch màu trắng ký hiệu EL5 (chất 3).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết nước của rễ cây mật nhân được mơ tả ở hình 2.3 và hình 2.4 [5].
n- hexane
Chiết Soxhlet trong 24 giờ
b. Nhóm hợp chất khác
Chiết trong ethyl acetate
Hình 2.5. Sơ đồ tạo cao chiết n-henxane và cao chiết ethyl acetate
Rễ mật nhân
Bả Lọc
Ngâm chiết với ethanol 85 % trong 3 giờ
Cô quay chân khơng (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0C, số vịng quay: 40
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60
0C, số vòng quay: 40
PĐE 34 550 mg
PĐE 34 1 PĐE 34 5 chọn PĐE 34 2 1,2 g
MN.34.2 (6 mg) (trắng)
SKC, dung môi rửa giải là MeOH/H2O 1/1 thu được 5 phân đoạn PĐE 34 1- PĐE 34 5
PĐE 25
SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn PĐE 1- PĐE 92
Cao chiết n-hexane (4,1 g)
PĐH 1…PĐH 10 chọn PĐH6
MNH1 (6 mg) (vàng)
SKC silica gel, hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn PĐH1- PĐH10
MN.25.10 (20 mg) (trắng)
Cao chiết ethyl acetate (35 g)
Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các chất khơng thuộc nhóm alkaloid
Tiến hành chiết Soxhlet trong n-hexane 3 kg bột rễ cây mật nhân trong 7 lít dung mơi trong 24 giờ, dịch chiết được lọc, gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 4,1 g cặn. Phần bã được ngâm chiết với ethanol 85 % 3 kg bã được chiết trong 8 lít dung mơi trong 3 giờ), khuấy ở nhiệt độ 50 oC và tiếp tục để ngâm qua đêm Sau ba lần chiết, dịch chiết được lọc và quay cất dưới áp suất giảm đến thể tích khoảng 500 mL. Cho ethyl acetate vào, chiết phân lớp ba lần (mỗi lần 250 mL). Dịch chiết ethyl acetate được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 69,1 g cặn chiết ethyl acetate.
Cao chiết n-hexane 4,1 g được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH (9,5:0,5 tăng dần đến 9:1 thu được 10 phân đoạn. Ở phân đoạn 6 thu được 6 mg một chất sạch màu vàng hình kim kết tinh được ký hiệu là MNH1 (chất 5).
Cao chiết ethyl acetate 35 g được phân tách bằng cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH 9,5:0,5 tăng dần đến 8:2 thu được 92 phân đoạn ký hiệu từ PĐE 1 đến PĐE 92 Phân đoạn PĐE 25 có 20 mg chất sạch dạng bột màu trắng kết
tinh được đặt tên là MN.25.10 (chất 6 Phân đoạn PĐE 34 550 mg được chạy cột Rp với hệ dung môi rửa giải là MeOH:H2O (1:1) thu được 5 phân đoạn ký hiệu từ PĐE 34 1 đến PĐE 34 5 Phân đoạn PĐE 34 2 có 25 mg chất sạch dạng bột màu trắng kết tinh được đặt tên là MN.34.2 (chất 7).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết n-hexane và cao chiết ethyl acetate của rễ cây mật nhân được mơ tả ở hình 2.5 và hình 2.6 [7].
2.4.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được
Cấu trúc hóa học của các chất sạch được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương pháp vật lý (tonc, []D và các phương pháp phổ hiện đại như: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ khối ion hóa bằng bụi electron (ESI- MS), phổ khối có độ phân giải cao (HR-ESI-MS , phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H- NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) [27] [28].
2.4.3. Phương pháp xây dựng quy trình chiết rễ mật nhân
Rễ cây mật nhân được ứng dụng để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm dưới dạng cao chiết hoặc bột được chiết xuất từ nước và cồn thực phẩm. Vì vậy, dung mơi được chúng tơi lựa chọn để thu nhận sản phẩm cao chiết từ rễ mật nhân là nước và ethanol 80 % Phương pháp chiết được chọn là phương pháp chưng ninh hồi lưu với nhiều lợi thế và hiệu quả như đã trình bày trong phần tổng quan.
- Mơ hình tiến hành thí nghiệm:
Hình 2.7. Hệ thống chưng ninh hồi lưu
Hệ thống chưng ninh hồi lưu: Bao gồm một bình cầu nối với ống sinh hàn và được đặt trên bể điều nhiệt. Ống sinh hàn với dòng nước lạnh chảy qua liên tục nên khi dung mơi bay hơi lên sẽ bị ngưng tụ trở lại bình do tránh sự tổn thất của cấu tử bị cuốn
Dung môi
Chưng ninh hồi lưu Rễ mật nhân
Bã
theo dung môi bay hơi dưới tác dụng nhiệt và tiết kiệm lượng dung môi. Quy trình chiết tổng quát được trình bày trên hình 2 8
Khảo sát các yếu tố: + Nhiệt độ chiết + Thời gian chiết + Tỷ lệ dung mơi/ ngun liệu
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình chiết
Bột rễ mật nhân được chưng ninh ở điều kiện nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu xác định, sau đó, tiến hành lọc chân khơng thu được dich chiết Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0C, số vịng quay: 40 vịng/phút). Phân tích đại lượng đầu ra đối với dịch chiết nước: Hàm lượng EL4 cao nhất, đối với dịch chiết ethanol 80 %: Hiệu suất chiết từ khối lượng cao khô trước và sau quá trình chiết
Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình chiết rễ mật nhân được trình bày tại phụ lục 2
2.4.3.1. Chiết rễ cây mật nhân trong dung mơi ethanol 80 %
Quy trình chiết rễ mật nhân trong dung môi ethanol 80 % dựa trên việc tham khảo và kế thừa các kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả C K Foong và cộng sự vào năm 2015, nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh, Mai Hưng Trấn vào năm 2017 [74] [84]. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết được tối ưu bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 3 yếu tố 2 mức, các mức yếu tố được lựa chọn lần lượt:
Cô quay chân không (Áp suất: 72 mbar, nhiệt độ: 60 0C, số vòng quay: 40 vòng/phút
Đo đại lượng đầu ra đối với dịch chiết: Hàm lượng EL4, đối với dịch chiết ethanol 80 %: Hiệu suất chiết
- X1: Nhiệt độ chiết 60 oC đến 80 oC;
- X2: Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20/1 mL/g đến 40/1 mL/g; - X3: Thời gian chiết 2 giờ đến 4 giờ;
- Hàm mục tiêu Y: Hiệu suất chiết cao nhất, trong đó, hiệu suất chiết được xác định bằng phương pháp cô quay chân không dung dịch lọc sau chưng ninh hồi lưu, sấy đến khối lượng cặn không đổi Hiệu suất chiết H, % là tỷ lệ phần trăm giữa khối lượng cao khô mật nhân thu được sau khi sấy khô m2, g với khối lượng mẫu thí nghiệm ban đầu (m1, g).
Các bước thực hiện quy hoạch thực nghiệm [85]:
Bước 1: Xác định một điểm xuất phát nằm trong miền giới hạn tổng thể của các biến
đầu vào. Chọn điểm đó làm mức cơ bản. Chọn khoảng biến thiên của từng biến để xác định miền giới hạn của quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1.
Bước 2: Thực hiên các thí nghiệm theo quy hoạch trực giao cấp 1. Xây dựng phương
trình hồi quy bậc nhất: Nếu phương trình hồi quy bậc nhất khơng tương thích thì chuyển đến thực hiện bước 4. Nếu phương trình hồi quy bậc nhất tương thích thì thực hiện bước 3.
Bước 3: Xác định vectơ gradient của hàm mục tiêu tại mức cơ bản và xuất phát từ
mức cơ bản xác định tọa độ các điểm thực nghiệm nằm cách đều nhau trên hướng của vectơ gradient với khoảng cách tự chọn phù hợp với đối tượng nghiên cứu. Làm thực nghiệm để xác định một điểm có giá trị hàm mục tiêu tốt nhất trên hướng gradient. Chọn điểm tìm được làm điểm xuất phát mới và quay về bước 2.
Bước 4: Thực hiên các thí nghiệm theo quy hoạch cấp 2 trực giao hoặc là tâm quay. Bước 5: Xây dựng phương trình hồi quy bậc hai:
Nếu phương trình hồi quy bậc 2 khơng tương thích thì chuyển tới thực hiện bước 6. Nếu phương trình hồi quy bậc hai tương thích thì thực hiện bước 7.
Bước 6: Thu hẹp khoảng biến thiên của các biến đầu vào rồi quay về bước 5.
Bước 7: Tìm cực trị của hàm mục tiêu thu được ở dạng phương trình hồi quy bậc 2 thu
được ở bước 5 và thực nghiệm lại để kiểm chứng và đánh giá kết quả. Phương trình biểu diễn mối quan hệ có dạng: Y = f(X1, X2, X3)
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm trên, lập các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm Các mức Các yếu tố ảnh hưởng Nhiệt độ X1 (oC) Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu X2 (mL/g) Thời gian X3 (giờ) Mức dưới 60 20/1 2 Mức cơ sở 70 30/1 3 Mức trên 80 40/1 4
Khoảng biến thiên 10 10/1 1
Chọn phương án quy hoạch trực giao cấp 1 (TYT2k) thực nghiệm yếu tố toàn phần 2 mức, k = 3 yếu tố ảnh hưởng Phương trình hồi quy có dạng:
Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3+ b12x1x2 + b23x2x3+ b13x1x3+b123x1x2x3 (2.1) [85] Trong đó: - x1: Nhiệt độ chiết (oC);
- x2: Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g). - x3: Thời gian chiết (giờ);
Với 3 yếu tố tối ưu k = 3 , số thí nghiệm phải thực hiện là N = 2k = 23 = 8 [85] thí nghiệm của quy hoạch trực giao cấp 1 và 3 thí nghiệm tại tâm phương án Tổ chức thí nghiệm và thu được kết quả thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Ma trận và kết quả thí nghiệm
TN Yếu tố thí nghiệm trong hệtọa độ khơng thứ ngun Yếu tố thí nghiệm Y (%) x0 x1 x2 x3 X1 (oC) X2 (mL/g) X3 (giờ) 1 + + + + 80 40/1 4 6,916 2 + - + + 60 40/1 4 5,566 3 + + - + 80 20/1 4 6,888 4 + - - + 60 20/1 4 5,702 5 + + + - 80 40/1 2 6,368 6 + - + - 60 40/1 2 5,602 7 + + - - 80 20/1 2 6,466 8 + - - - 60 20/1 2 5,442 T1 + 0 0 0 70 30/1 3 6,476 T2 + 0 0 0 70 30/1 3 6,476 T3 + 0 0 0 70 30/1 3 6,610 Trong đó:
+ T1, T2, T3 là thí nghiệm tại tâm phương án; + X1, X2, X3 là các thông số tối ưu;
+ x1, x2, x3 là các biến mã không thứ nguyên tương ứng với X1, X2, X3
2.4.3.2. Chiết rễ mật nhân trong dung môi nước
a. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rễ mật nhân bao gồm: Nhiệt độ chiết, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu. Các số liệu chọn để bố trí các thí nghiệm được kế thừa từ các kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả C K Foong và cộng sự vào năm 2015, nhóm tác giả Trương Thị Minh Hạnh, Mai Hưng Trấn vào năm 2017 [74] [84].
Cách bố trí thí nghiệm được tình bày cụ thể sau:
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến q trình chiết rễ mật nhân Thí nghiệm được thực hiện với các thơng số được trình bày ở bảng 2 3.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố nhiệt độ
Số thứ tự mẫu 1 2 3 4
Nhiệt độ chiết (oC) 70 80 90 100
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g) 20/1
Thời gian chiết (phút) 120
Hàm lượng EL4 (mg/kg) Y1 Y2 Y3 Y4
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/ ngun liệu đến q trình chiết mật nhân Thí nghiệm được thực hiện với các thơng số được trình bày ở bảng 2 4.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Số thứ tự mẫu 5 6 7 8
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (mL/g) 10/1 20/1 30/1 40/1
Thời gian chiết (phút) 120
Nhiệt độ chiết (oC) Đã khảo sát tại thí nghiệm 1
Hàm lượng EL4 (mg/kg) Y5 Y6 Y7 Y8
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến q trình chiết mật nhân Thí nghiệm được thực hiện với các thơng số được trình bày ở bảng 2 5.
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố thời gian chiết
Số thứ tự mẫu 9 10 11 12
Thời gian chiết (phút) 60 90 120 150
Nhiệt độ chiết (oC) Đã khảo sát tại thí nghiệm 1 Tỷ lệ dung mơi/ngun liệu (mL/g) Đã tối khảo sát thí nghiệm 2
Hàm lượng EL4 (mg/kg) Y9 Y10 Y11 Y12
Hàm mục tiêu Y: Hàm lượng chất EL4 cao nhất Định lượng chất EL4 có trong mẫu bằng hệ thống HPLC dựa trên nguyên tắc: Xác định diện tích pic trên sắc k đồ tại thời điểm mà thời gian lưu của mẫu trùng với thời gian lưu của chất chuẩn EL4. Sau đó từ đường chuẩn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic suy ra hàm lượng chất EL4 [23].
Điều kiện sắc ký:
- Pha động: MeOH : H2O = 70 % : 30 %