Nghiên cứu trên vừus cúm A. Xem phụ lục 1.
2.2.3.I. Hấp thụ, xâm nhập và cỏi yỏ
Hấp thụ: Virus cúm gắn với phần acid sialic của glycoprotein hoặc
glycolipid trên bề mặt tế bào bằng receptor gắn trên phân tử HA. Những type virus cúm khác nhau có kiểu gắn khác nhau, có thể là a - 2, 6 hoặc a - 2, 3
* Hcmaggiijtinzi (HA) T Ncuraminidaic (NA) á HAxecẹpicr Protein M2 õ Amamadin □ Cbít úc chế NA. (NÀI) PH Ụ LỤ C 1: C H U K Ì N H Â N LÊ N C Ủ A V IR U S IN F L U E N Z A
phụ thuộc vào những acid amin đặc biệt trên thụ thể của HA. Mặc dù ái lực tương tác giữa HA và acid sialic là thấp nhưng với mật độ virus dày đặc trên bề mặt tế bào thì việc hấp thụ vẫn xảy ra khá dễ dàng^22], [24], [JL3].
Xâm nhập: Virus cúm xâm nhập vào tế bào bằng cách nhấn chìm hay
còn gọi là nhập bào qua trung gian receptor và xuất hiện trong các bọng vùi trong tế bào chất. Các bọng vùi này có phủ một lớp clathrin ở bên ngoài, sau đó lớp vỏ clathrin bị loại bỏ và sự cỏi vỏ bắt đầu [22], [13].
Cởi vỏ; Sự cởi vỏ của virus trong các bọng vùi phụ thuộc vào pH. Kênh
Ị
ion M2 được hoạt hoá sẽ bơm H+ vào trong thể thực bào và làm giảm pH trong khoang đó. Liên kết HA và Mị trở nên lỏng lẻo kéo theo sự lỏng lẹo liên kết giữa Mj và RNPs. Khi pH giảm tới khoảng pH=5 - 6, cấu dạng C]L h a bình thường sẽ thay đổi sang cấu dạng HA ở pH thấp. Khi đó, sự hóà màng giữa màng virus và màng tế bào sẽ xảy ra và những RNP virus nguyên vẹn sẽ được giải phóng vào tế bào chất. RNP sẽ chui qua lỗ nhân vào trong nhân để thực hiện việc sao chép và tái bản [22], [24].
Hình 2.9: Sự hoà màng của virion và màng thể thực bào.
Giai đoạn nhiễm khỏi đầu kéo dài khoảng 20 - 35 phút tính từ khi virus bắt đầu hấp thụ lên bề mặt tế bào [24].
Một số tác nhân có bản chất base yếu (NH4C1, Cloroquin...) có thể làm tăng pH trong thể thực bào do đó ngăn chặn sự cởi cỏ của virus. Tuy nhiên những base yếu đó không phải là chất chống cúm đặc hiệu vì khả năng làm tăng pH có thể ngăn chặn sự cởi vỏ của hầu hết virus mà vào tế bào bằng con đường nhập bào.
Amantadin là 1 thuốc chống virus do ức chế kênh ion M2 ngăn chặn virus nhân lên ở giai đoạn sớm là giai đoạn cởi vỏ. Tuy nhiên sau 1 khoảng thời gian nhất định, sự hoà màng vẫn sẽ xảy ra do lyzosome. Nhưng khi đó protein Mj sẽ không tách ra mà tồn tại ở dạng liên kết yếu giữa Mj và phần đuôi trong bào tương của HA, giữa Mị và RNP. Do đó việc vận chuyển RNP vào trong nhân bị ngăn chặn [22].
2.2.3.2. Sao chép và bộc lộ gen
Như đã trình bày ở trên, virus cúm A có chứa 8 phân đoạn genom. Mỗi phân đoạn gọi là ARNv chứa 12 và 13 nucleotid được bảo toàn ở đầu 3’ và 5’. Hai nucleotide đầu tận 5’ là AG bổ sung với hai nucleotide đầu tận 3’ là uc. ARNv sẽ được sao chép thành ARNm và được tái bản thành ARNv con thông qua một ARNc (ARN khuôn). Cả 3 loại ARN đặc biệt của virus trên đều được tổng hợp trong nhân tế bào [22], [24].
ARNm được gắn vói cấu trúc CAP (m7GpppXm) và 10-13 nucleotide ở
phần đầu tận 5’ xuất phát từ ARNm của tế bào vật chủ. Phần đầu 3’ có chuỗi polyadenin được bổ sung từ phân đoạn gồm 5 - 7 uridin trước đầu 5’ của ARNv 1 5 - 2 2 nucleotide. Do đó ARNrn sẽ ngắn hơn ARNv 1 5 - 2 2 nucleotide [24].
ARNc có độ dài bằng ARNv, trình tự nucleotide của ARNc hoàn toàn tuân theo qui luật bổ sung với ARNv. ARNc kết hợp với ARNv tạo thành chuỗi xoắn kép giả. ARNc là trung gian để tổng hợp ARNv con [22].
5' ARNm ~èGC I a a a g c a g g VA -A A A A - ARNv 5* 3' UCG ỰƯUUCGUCC--- --- --- --- G G A A C A A A G A Ư G A t ARNc
5 ' pppAGC ^AAAGCAGG--- CCUUGUUUCUACU 3 '
Hình 2.10: Cấu tạo các ARN đặc biệt của virus.
Tổng hợp ARNm virus:
Hình 2.11: Sơ đồ tổng hợp ARNm.
Lúc đầu hợp phần gồm 3 protein polymerase ở dưới dạng không hoạt động. Sau khi gắn với đầu 5’ của ARNv và gắn với yếu tố khởi đầu của ARNm tế bào chủ ở tiểu phần PB2, ARNv sẽ bị gập lại tạo thành dạng kẹp tóc do 4 nucleotide có tính chất bổ sung nằm ở hai đầu tận của ARNv đã được đề cập ở trên. Và chính điều đó sẽ hoạt hoá enzyme endonuclease của hợp phần sao chép. Điều này có thể xảy ra trước hoặc sau khi gắn với yếu tố khỏi đầu của ARNm tế bào chủ. Sau đó việc phân cắt đoạn nối ARNm tế bào chủ sẽ xảy ra, hợp phần sao chép được kích hoạt hoàn toàn [22].
Hình 2.11: Sơ đồ tổng hợp ARNm (tiếp).
Khởi đầu quá trình sao chép xảy ra ở base áp chót, sau đó ARNv tiếp tục trượt qua hợp phần sao chép và ARNm được kéo dài. Đầu 5’ của ARNv tiếp tục gắn chặt với hợp phần 3P trong suốt quá trình sao chép, còn cấu trúc nối khởi đầu gắn với tiểu phần PB2 sớm tách ra sau khi kéo dài. Sự tổng hợp
chuỗi polyadenin xảy ra ở đoạn oligo u gần kề đầu tận 5’, cách đầu 5’ từ 15 - 22 nucleotide do một cơ chế suy giảm không cho phép sư sao chép tiếp tục xảy ra. Sự tổng hợp ARNm kết thúc [22].
Tái bản ARNv con: Sự tái bản ARNv con xảy ra theo 2 bước: tổng hợp
ARN khuôn và sao chép ARN khuôn thành ARNv [22].
Bộc lộ gen: các ARN đặc biệt của virus được tổng hợp trong nhân tế bào, sau đó ARN khuôn tiếp tục ở lại trong nhân để tái bản thành ARNv con còn ARNm được vận chuyển ra bào tương đến ribosome để dịch mã ra các protein virus. Giai đoạn bộc lộ gen này chia thành 2 phase sớm và muộn [22].
- Phase sớm: sự tổng hợp ARNv con, ARNm và protein là song song tỷ lệ thuận với nhau. Đầu tiên ARN khuôn được tổng hợp đạt đến đỉnh sau đó giảm dần. ARN khuôn sẽ sao chép thành các ARNv con.
ARNv, ARNm của NS, NP cũng như các protein tương ứng được tổng hợp sớm. Còn ARNv, ARNm và protein Mj thì bị trì hoãn. Do đó việc tổng hợp protein trong giai đoạn sớm phụ thuộc vào sự tổng hợp ARNv, phụ thuộc vào sự sao chép chọn lọc của ARN khuôn thành ARNv.
- Phase muộn: sự tổng hợp ARNv con, ARNm và protein tương ứng là không còn tỷ lệ với nhau. ARNm tổng hợp đạt đến đỉnh ở đoạn đầu phase muộn sau đó giảm dần còn tổng hợp ARNv và protein luôn giữ ở vị trí max hoặc cận max trong suốt phase 2.
Hai protein là Mị và HA được tổng hợp rất ít ở phase sớm thì đến phase muộn lại được tổng hợp rất nhiều cùng với các protein cấu trúc khác.
Việc sớm tổng hợp NS và NP và việc trì hoãn tổng hợp Mị có liên quan đến việc điều khiển quá trình tổng hợp các thành phần virus. NP được tổng hợp rất sớm vi nó cần thiết cho tổng hợp ARN khuôn và ARNv con. NSj thì có vai trò quan trọng giúp ARNm xuất nhân ra bào tương để tổng hợp protein. Ngoài ra còn có vai trò ức chế việc nối lại các đoạn ARNm của tế bào chủ khi bị cắt trong quá trình sao chép ARNm virus. Trong khi đó protein M, bị trì
hoãn vì nó sẽ làm dừng việc sao chép ARNv thành ARNm và việc vận chuyển ARNv ra tế bào chất [22].
2.2.3.3. Hợp nhất, trưởng thành và phóng thích virion
Các protein xuyên màng HA, NA, M2, NB được tổng hợp ở ribosome sau đó được vận chuyển qua màng lưới nội chất. Tại đây HA bị phân cắt bởi peptidase trong khi đó NA, NB, M2 thì không bị phân cắt. Việc gắn những chuỗi carbonhydrat vào HA, NA, NB được thực hiện tại bộ máy Golgi (M2 không có phản ứng glycosilate này). Sau đó các protein này được vận chuyển đến màng và gắn xuyên qua lớp màng lipid kép của tế bào vật chủ [22].
Các protein NP, PBị, PB2 và PA cũng được tổng hợp trong bào tương sau đó được vận chuyển vào trong nhân dưới dạng một tổ hợp. Tổ hợp này sẽ kết hợp vói RNA tạo thành RNP.
Như chúng ta đã biết ở trên, sau khi hoà màng, RNP sẽ tách khỏi liên kết với Mj giải phóng vào bào tương và chui qua lỗ nhân để vào nhân thực hiện quá trình sao chép và tái bản. Những RNP mới tổng hợp sẽ lại được vận chuyển ngược lại bào tương và kết hợp với protein Mị. Sự vận chuyển xuất- nhập nhân này của RNP là rất quan trọng trong quá trình nhân lên của virus và protein M1 đóng vai trò điều khiển sự vận chuyển đó. Nếu có một điều kiện nào đó làm M, không tách ra khỏi RNP (như có sự có mặt của Amantadin) thì RNP không thể vào trong nhân và sự sao chép cũng không xảy ra. Trong tế bào nhiễm virus, Mj khu trú cả ở trong nhân và trong bào tương vì M, được tổng hợp trong tế bào chất và có khả năng khuếch tán thụ động vào trong nhân. Tại nhân Mj cũng có thể kết hợp vói RNP làm cho sự vận chuyển RNP ngược trở lại bào tương bị gián đoạn.
Khi có mặt của những chất ức chế M2, sự vận chuyển H+ ra khỏi khoang bộ máy Golgi bị ngăn chặn làm pH trong khoang giảm và HA có thể chuyển từ dạng bình thường sang dạng HA ở pH thấp. Và khi đó việc hợp nhất virion sẽ
I
bị lỗi. Sự liên kết tự nhiên giữa protein với protein cần thiết cho sự trưởng thành của virion cho đến nay vẫn chưa được biết rõ [22].
Protein Mj kết hợp với cả RNP và lớp màng lipid kép của tế bào vật chủ đã được gắn những protein màng và virion sẽ giải phóng bằng cách nảy chồi. Để giải phóng hoàn toàn virion khỏi tế bào vật chủ thì sự có mặt của Neuraminidase là vô cùng cần thiết. Neuraminidase sẽ cắt dây nối giữa acid sialic và galactose hoặc galactosamin, loại bỏ acid sialic khỏi HA, NA và bề mặt tế bào. Khi đó các virion con sẽ hoàn toàn tách ra, chúng sẽ đi đến những tế bào khác và tiếp tục một quá trình nhân lên khác [8], [22]. Tổng thời gian từ lúc virus xâm nhập đến lúc giải phóng hoàn toàn ra khỏi tế bào vật chủ là 6 giờ [24].