L ỜI CAM ĐOAN
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3.5. Sự phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo
Cụm mô sẹo 16 tuần tuổi của rong Bắp sú được lấy từ kết quả của thí nghiệm nhân nhanh mơ sẹo có kích thước khoảng 2 x 2 mm và khối lượng khoảng 10 mg sau đó được đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL mơi trường PES đặc (15 g.L-1 agar); hoặc môi trường PES bán lỏng (4 g.L-1 agar); hoặc môi trường PES lỏng nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của độ rắn môi trường đối với khả năng phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo rong Bắp sú. Sau đó, sử dụng trạng thái vật lí mơi trường tối ưu ở trên, bổ sung đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (1; 2; 3 mg.L-1) hoặc BAP (1; 2; 3 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA hoặc BAP) nhằm xác định được loại và nồng độ CĐHSTTV phù hợp đối với khả năng phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo rong Bắp sú.
Môi trường nuôi cấy là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 –35‰ đã đượclọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh hàm lượng agar và các CĐHSTTV phù hợp. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Đối với nghiệm thức môi trường PES đặc và PES bán lỏng, mỗi nghiệm thức được cấy 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu. Ở nghiệm thức môi trường PES lỏng được cấy vào 30 bình cầu đáy bằng 100 mL có chứa 40 mL mơi trường, mỗi bình cầu chứa 1 mẫu.Các đĩa petri và bình cầu đáy bằng chứa mẫu cấy được đặt dưới điều kiện in vitro. 2.3.3.6. Khả năng tái sinh cây con và thích nghi điều kiện sống tự nhiên
Ảnh hưởng của một số yếu tốđối với khảnăng tái sinh cây con từ phơi vơ tính
Những mẫu có chứa các phơi vơ tính rong Bắp sú được ni cấy trong bình cầu đáy bằng 250 mL có chứa 200 mL môi trường PES lỏng và được lắc 100 vòng/phút trong thời gian 2 tuần. Sau khi các phôi rời nhau, tiến hành lọc và chọn những phơi đồng đều nhau có kích thước 0,5 – 0,6 mm, có đặc tính khỏe để làm các thí nghiệm tái sinh cây con. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại mơi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không
bổ sung dinh dưỡng); (2) sự xáo trộn của nước: Lắp hệ thống sục khí, hoặc đặt lên máy lắc có tốc độ lắc lần lượt là 50 vòng/phút và 100 vòng/phút; (3) CĐAS: 0; 15;
35; 55; 75 µmol photons.m-2.s-1 dưới ánh sáng trắng đèn huỳnh quang; (4) độ mặn:
20; 25; 30; 35; 40‰; (5) nhiệt độ: 20; 25; 27; 30; 35°C được kiểm tra để tìm ra điều kiện tái sinh cây con tốt nhất. Môi trường nuôi trồng là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh độ mặn và môi trường dinh dưỡng.Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức ba bình cầu đáy bằng có thể tích 250 mL chứa 200 mL mơi trường, mỗi bình cầu chứa 10 phơi.
Giai đoạn thích nghi ngồi tự nhiên của cây con có nguồn gốc in vitro
Giai đoạn cuối cùng của nhân giống in vitro là chuyển cây con ra ngoài điều kiện ni trồng tự nhiên. Tỉ lệ sống sót của cây khi chuyển ra điều kiện ex vitro được quyết định bởi nhiều yếu tố như tình trạng sinh lý của cây, kích thước cây con và các yếu tố môi trường như nguồn ánh sáng. Trong các yếu tố đó, kích thước cây con và nguồn ánh sáng đóng vai trị rất quan trọng quyết định tỉ lệ sống sót của cây ở giai đoạn thích nghi để cây con quen với điều kiện tự nhiên. Kích thước cây con phù hợp để đưa ra ngồi ni trồng ở điều kiện tự nhiên giúp tăng tỉ lệ sống sót và giảm chi phí sản xuất. Bên cạnh đó, thiết lập một hệ thống cung cấp ánh sáng phù hợp cho từng loại cây con in vitro để cây thích nghi với điều kiện ánh sáng tự nhiên trước khi chuyển ra điều kiện ex vitro đảm bảo cho cây quang hợp và sinh trưởng tốt.
Cây con 8 tuần tuổi có nguồn gốc in vitro, kích thước khoảng 2,5 cm, khối
lượng khoảng 1 g và 5 – 8 nhánh được cố định vào mảnh vụn san hô hoặc đá, đặt trong bể kính có thể tích 100 L, kích thước 25 x 35 x 50 cm, sục khí liên tục, có hệ thống điều nhiệt để đạt được nhiệt độ 25 – 27°C và đặt dưới các nguồn ánh sáng khác
nhau (Bảng 2.2) nhằmkhảo sát ảnh hưởng của nguồn ánh sáng đối với khả năng sinh
trưởng cây con có nguồn gốc in vitro ở giai đoạn thích nghi bán tự nhiên. CĐAS của các nguồn ánh sáng khác nhau được xác định vào 12 giờ trưa và được đo tại đáy bể. Chu kì chiếu sáng 10 giờ/ngày đối với các nghiệm thức sử dụng hệ thống chiếu sáng. Theo dõi sự phát triển của rong và màu nước hàng ngày. Môi trường nuôi trồng là môi trường PES được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới
có kích thước lỗ 22 µm. Thay nước và bổ sung mơi trường dinh dưỡng 1 tuần/lần. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức 3 bể kính, mỗi bể kính chứa 10 cây.
Bảng 2.2. Các thông số nguồn ánh sáng khác nhau Nguồn ánh sáng Đặc điểm CĐAS (µmol photons.m-2.s-1) 1 Ánh sáng trắng đèn huỳnh quang 55 2 Ánh sáng trắngđènhuỳnh quang 75 3 Đèn led 150
4 Ánh sáng tự nhiên có giảm ½ CĐAS bằng mái che
(mái tôn trong và lưới màu xanh đen) 250
5 Ánh sáng tự nhiên 500
Cùng với nguồn ánh sáng, loại cây con cũng được kiểm tra. Cây con 8 tuần tuổi có nguồn gốc in vitro với các kích thước, số nhánh và khối lượng khác nhau được chuyển ra nuôi trồng ex vitro nhằm khảo sát ảnh hưởng của loại cây con có nguồn gốc in vitro đối với khả năng sinh trưởng ở giai đoạn thích nghi bán tự nhiên. Tiến hành theo dõi sáu loại cây con in vitro (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây con in vitro trước khi thí nghiệm
Loại cây Số nhánh (nhánh/cây) Kích thước (cm) Khối lượng (g)
1 3,00 ± 1,00 0,52 ± 0,06 0,36 ± 0,08 2 4,33 ± 1,15 1,0 ± 0,09 0,53 ± 0,06 3 4,67 ± 0,58 1,49 ± 0,10 0,63 ± 0,12 4 6,00 ± 1,00 2,06 ± 0,16 0,86 ± 0,05 5 6,33 ± 0,58 2,52 ± 0,10 0,96 ± 0,05 6 6,67 ± 0,58 3,01 ± 0,12 1,23 ± 0,06
Rong được cố định vào mảnh vụn san hơ hoặc đá, đặt trong bể kính có thể tích 100 L, kích thước 25 x 35 x 50 cm, sục khí liên tục, có hệ thống điều nhiệt để đạt được nhiệt độ 25 – 27°C và được đặt dưới nguồn ánh sángtối ưu ở thí nghiệm trên. Theo dõi sự phát triển của rong, màu nước hàng ngày. Môi trường nuôi trồng là môi trường PES được pha bằng nước biển có độ mặn 30 –35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Thay nước và bổ sung mơi trường dinh dưỡng 1 tuần/lần. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức 3 bể kính, mỗi bể chứa 10 cây.
giá chất lượng cây giống. Cây con có nguồn gốc in vitro đạt kích thước khoảng 50 – 70 g và đối chứng là rong có nguồn gốc ngồi tự nhiên đang sinh trưởng tốt có khối lượng khoảng 100 g. Các bụi rong này được tách thành những bụi có kích thước khoảng 50 g/bụi và được buộc vào dây. Khoảng cách giữa các bụi rong là 40 cm được cố định vào giàn và đặt xuống nước với độ sâu 50 cm [144]. Điều kiện nuôi trồng tự nhiên ở vịnh Vân Phong, Khánh Hịa. Thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng thích nghi của cây con rong Bắp sú có nguồn gốc in vitro ở điều kiện sinh thái tự nhiên. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức 30 bụi cây/nguồn gốc giống.
Bước cuối cùng của nhân giống in vitro là đánh giá hàm lượng và chất lượng carrageenan của rong Bắp sú có nguồn gốc in vitro. Thu thập rong có nguồn gốc in
vitro và rong ngoài tự nhiên 10 tuần tuổi được ni ngồi tự nhiên ở vịnh Vân Phong.
Rong thu về được rửa sạch dưới vòi nước nhiều lần nhằm loại bỏ cát, đá, tảo tạp và sinh vật bám. Tiếp theo, rong được phơi khô dưới ánh sáng mặt trời. Những mẫu rong này được dùng để xác định hàm lượng và chất lượng carrageenan. Thí nghiệm nhằm đánh giá hàm lượng và chất lượng carrageenan của rong Bắp sú có nguồn gốc in vitro
ni trồng ở điều kiện sinh thái tự nhiên.