L ỜI CAM ĐOAN
3.2. Nhân giống dòng rong nâu Sacol thuộc loài rong Bắp sú
3.2.2.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đối với sự cảm ứng mô sẹo
Mẫu vô trùng được cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, có bổ
sung 15 g.L-1 agar để làm đông môi trường. Kết quả thấy rằng, sau 8 tuần ni cấy ở
mơi trường PES, mẫu có tỉ lệ cảm ứng (82,2%), tỉ lệ sống mô sẹo (85,1%) cao nhất và kích thước mơ sẹo (1,83 mm) lớn nhất so với các nghiệm thức còn lại (Bảng 3.4 và Hình 3.5. E).
Các mơi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến cảm ứng mơ sẹo dịng nâu Sacol. Nhìn chung, ở hầu hết các mơi trường dinh dưỡng cịn lại (½ PES, PES ½, MPI, ½
MPI, MPI ½), mơ sẹo đều cảm ứng với tỉ lệ khá cao (67,8 – 72,2%). Tuy nhiên, tỉ lệ
sống của mô sẹo có sự khác biệt giữa các nghiệm thức và mô sẹo phát triển chậm, cụm mô sẹo nhỏ (0,40 – 1,53 mm) (Bảng 3.4 và Hình 3.5. F – J). Đối với mơi trường
MS, ½ MS và MS ½ khơng phù hợp cho mẫu cảm ứng mô sẹo. Ởmôi trường MS, đa
số mẫu rong bị đỏ thân, nhũn và hoại tử hồn tồn; một số mẫu cịn sống nhưng không cảm ứng mô sẹo. Sau 8 tuần, tồn bộ mẫu cịn lại mất màu và trắng hồn tồn (Hình
3.5. B, C, D). Ở nghiệm thức đối chứng mơ sẹo hoại tử hồn tồn sau 8 tuần ni cấy (Bảng 3.4).
Hình 3.5. Hình thái mơ sẹo của dịng rong nâu Sacol ở các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy. Thước: 2 mm
A: Mẫu ban đầu
B, C, D: Mẫu được ni trong mơi trường MS, ½ MS, MS ½; tương ứng
E, F, G: Mẫu được ni trong mơi trường PES, ½ PES và PES ½; tương ứng H, I, J: Mẫu được nuôi trong mơi trường MPI, ½ MPI và MPI ½; tương ứng
Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro cần cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như axit amin, vitamin, nguồn cacbon cố định và một số thành phần cho sự sống. Hiện nay, có rất nhiều mơi trường được sử dụng như: MPI [77], PES [48], MS [79], ASP12-NTA [80], ESS/2 [54] và VS
50% [52]. Trong đó mơi trường PES được đánh giá là phù hợp với nhiều lồi rong
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng đối với cảm ứng mơ sẹo dịng rong nâu Sacol sau 8 tuần nuôi cấy, n = 30 Môi trường dinh dưỡng Tỉ lệcảm ứng mô sẹo (%) Tỉ lệsống mô sẹo (%) Kích thước
mơ sẹo (mm) Mơ tả hình thái
Đối chứng 41,1c ± 2,8 Hoại tử Hoại tử Mẫu hoại tử sau vài ngày nuôi.
MS Hoại tử Hoại tử Hoại tử
Sau 2 –3 ngày nuôi cấy 80% mẫu bị đỏ thân, hoại tử hoàn hoàn sau 7 ngày cấy mẫu, khoảng 20% mẫu cịn sống nhưng khơng cảm ứng tạo mô sẹo, nuôi thời gian lâu hơn mẫu hoại tử hồn tồn.
½ MS Hoại tử Hoại tử Hoại tử
Sau 2 –3 ngày nuôi cấy 70% mẫu bị đỏ thân, sau 7 ngày thì hoại tử, khoảng 20% mẫu cịn sống nhưng khơng cảm ứng tạo mô sẹo sau 8 tuầnnuôi cấy, nuôi thời gian lâu hơn mẫu hoại tử hồn tồn.
MS ½ Hoại tử Hoại tử Hoại tử
Khoảng 80% mẫu bị đỏ thân, nhạt màu sau 2 –3 ngày nuôi cấy, 20% mẫu sống nhưng không cảm ứng tạo mô sẹo sau 8 tuầnnuôi cấy, nuôi thời gian lâu hơn mẫu hoại tử hoàn toàn.
PES 82,2a ± 0,6 85,1a ± 2,5 1,83a ± 0,15 Mơ sẹo dạng sợi có màu sắc từ trắng hơi nâu và phát triển tốt.
½ PES 70,0b ± 1,9 73,1b ± 1,8
1,40b ± 0,10
Mơ sẹo có hình thành nhưng phát triển chậm, cụm mô sẹo nhỏ, mô sẹo dạng sợi có màu sắc từ trắng đến nâu.
PES ½ 72,2b ± 3,4 75,4b ± 1,3
1,53b ± 0,35
Mơ sẹo dạng sợi có màu sắc trắng hơi nâu, mô cấy bị nhạt màu, mô sẹo phát triển chậm.
MPI 70,0b ± 3,8 55,7c ± 3,1 1,30b ± 0,10 Mơ sẹo có cảm ứng hình thành nhưng phát triển nghèo nàn. ½ MPI 68,9b ± 5,3 30,7d ± 0,5
1,00c ± 0,10
Mơ sẹo có cảm ứng hình thành nhưng phát triển khơng tốt, có mơ sẹo bị hoại tử.
MPI ½ 67,8b ± 8,6 28,1d ± 3,3 0,47d ± 0,15 Xuất hiện mô sẹo dạng “compact”, mô sẹo dạng sợi. Ghi chú: Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê với phép thử Ducan (với p < 0,05).
Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đối với tỉ lệcảm ứng mô sẹo đã được báo cáo trước đây. Mơ rong Sụn ni ở mơi trường PES có tỉ lệ cảm ứng mô sẹo 80 – 100% [48], tỉ lệ này là 90% ở môi trường F/2 50 [50]. Môi trường VS 50, F/2 50 và
ASP 12 có tỉ lệcảm ứng mơ sẹo rong Sụn 40 – 100% [50]. Kết quả này phù hợp với
kết quả nghiên cứu của Reddy và cộng sự [48], ở môi trường PES tỉ lệ mô sẹo cảm ứng cao (80%) [48]. Do đó, mơi trường PES được sử dụng để cảm ứng mơ sẹo trong
những thí nghiệm tiếp theo.
Tiếp theo, mẫu vô trùng được cấy vào môi trường PES bổ sung NAA và BAP ở các nồng độkhác nhau (có bổ sung 15 g.L-1agar để làm đơng mơi trường). Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thấy rằng bổ sung NAA và BAP vào môi trường PES không làm gia tăng tỉ lệ cảm ứng cũng như tỉ lệ sống và kích thước mơ sẹo (Bảng 3.5 và Hình 3.6).
Bổ sung NAA và BAP vào mơi trường PES đã ảnh hưởng tiêu cực đối với tỉ lệ cảm ứng, tỉ lệ sống cũng như kích thước của mơ sẹo ở tất cả các nồng độ khác nhau. Mơ sẹo được tìm thấy ở tất cả các nghiệm thức không bổ sung hoặc bổ sung NAA và BAP. Tuy nhiên, tỉ lệ cảm ứng mô sẹo ở các nghiệm thức bổ sung NAA và BAP (57,7 – 61,3%) thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (75,7%) (Bảng 3.5). Mơ sẹo có tỉ lệsống cao nhất trên môi trường đối chứng (không bổ sung CĐHSTTV) là 77,3%. Mơ sẹo phát triển và đạt kích thước lớn nhất (2,4 mm), cụm mơ sẹo có màu trắng và xốp. Đối với các môi trường bổ sung NAA và BAP, tỉ lệ sống thấp và mô sẹo chậm phát triển (1,4 – 1,7 mm) (Bảng 3.5 và Hình 3.6).
Các CĐHSTTV đóng vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt sự sinh trưởng, biệt hóa, phát triển của thực vật nói chung và rong biển nói riêng. Mức độ kiểm sốt phụ thuộc vào loài, từng giai đoạn ở mỗi nồng độ và loại CĐHSTTV khác nhau.
Auxin có vai trị kích thích cảm ứng và sinh trưởng của mơ sẹo. Tuy nhiên, vai trị
của auxin lên q trình cảm ứng mơ sẹo tùy thuộc vào sự kết hợp giữa các chất và nồng độ. Các cytokinin cũng được dùng cho cảm ứng phát sinh hình thái ở các loài thực vật hai lá mầm và loại cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy là BAP.
Hình 3.6. Hình thái mơ sẹo của dịng rong nâu Sacol ở mơi trường PES có bổ sung NAA và BAP đơn lẻ hoặc kết hợp sau 8 tuần nuôi cấy. Thước: 2 mm A: Đối chứng B: 0,1 mg.L-1 NAA C: 1,0 mg.L-1 NAA D: 0,1 mg.L-1 BAP E: 1,0 mg.L-1 BAP F: 0,1 mg.L-1 NAA + 0,1 mg.L-1 BAP G: 1,0 mg.L-1 NAA + 1,0 mg.L-1 BAP H: 0,1 mg.L-1 NAA + 1,0 mg.L-1 BAP
Có nhiều nghiên cứu đưa ra kết luận trái chiềuvề ảnh hưởng của NAA và BAP đối với sự cảm ứng mô sẹo rong biển. Dawes và Koch [51] báo cáo rằng NAA và BAP ảnh hưởng mạnh mẽ đối với sự phát triển mô sẹo rong Sụn [51]. Tương tự,
Huang và Fujita [156] cũng cho rằng khi bổ sung BAP với nồng độ 0,1 – 1 mg.L-1đã
nâng cao tỉ lệ cảm ứng mơ sẹo và kích thước mơ sẹo của hầu hết các lồi được nghiên
cứu bao gồm: Ptilophora subcostata, Gloiopeltis tenax, C. prolifera, Grateloupia
acuminata, G. filicina, Pionitis crispata... Bên cạnh đó, Moz và cộng sự [90], Sulistiani và cộng sự [49] cũng khẳng định rằng bổ sung 0,1 – 1 mg.L-1 BAP kích thích cảm ứng mơ sẹo rong Sụnvới tỉ lệ (70 – 100%). Tuy nhiên, đối với lồi rong
Meristotheca papulose, BAP chỉ nâng cao kích thước mô sẹo mà không ảnh hưởng
tới tỉ lệ cảm ứng mô sẹo [156]. Ngược lại, bổ sung BAP đơn hoặc kết hợp với NAA đã gây ức chế đối với sự cảm ứng mô sẹo rong Gelidiella acerosa. Ở nồng độ 0,1 –
1 mg.L-1 BAP không nâng cao tỉ lệ cảm ứng mô sẹo nhưng đã giảm tỉ lệ sống của mô
sẹo rong Sụn [157]. BAP khơng kích thích sự cảm ứng phát sinh mơ sẹo rong Sụn mà cần kết hợp với một CĐHSTTV khác [158]. Như vậy, sự ảnh hưởng của BAP đối với cảm ứng mô sẹo được nhiều tác giả chứng minh là phụ thuộc vào lồi.
NAA kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo dạng sợi rong Agardhiella subulata khi bổ sung đơn lẻhoặc kết hợp với một CĐHSTTV khác ở mơi trường ASP 12 [159]. NAA kích thích cảm ứng mơ sẹo rong Chorzdrus crispus ở nồng độ 10-6 M [61]. Bổ
sung 0,1 mg.L-1 NAA trong môi trường PES kích thích đối với sự cảm ứng hình thành
mơ sẹo nhánh rong Sụn [90]. Dawes và Koch [160] cho rằng sự cảm ứng mô sẹo rong rong Sụn gai và rong Sụn ảnh hưởng bởi sự kết hợp nhóm auxin và cytokinin, các mô cấy rong Sụn gai bị hoại tử hồn tồn khi ni ở mơi trường có bổ sung 10 mg.L-1
NAA. Môi trường ESS bổ sung 1 mg.L-1 NAA có tỉ lệ cảm ứng mơ sẹo rong Sụn cao
nhất sau 4 tuần nuôi [160]. Ở nghiên cứu này có kết quả phù hợp với nhận định của Reddy và cộng sự [48], Vũ Thị Mơ và Reddy [157] cho rằng nồng độ 0,1 – 1,0 mg.L-1 NAA không nâng cao cảm ứng mô sẹo rong Sụn [157].
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của NAA và BAP đơn lẻ hoặc kết hợp đối với cảm ứng mơ sẹo dịng rong nâu Sacol sau 8 tuần nuôi cấy, n = 30 CĐHSTTV (mg.L-1) Tỉ lệ cảm ứng (%) Tỉ lệsống (%) Kích thước
mơ sẹo (mm) Mơ tả hình thái
0 75,7a ± 2,5 77,3a ± 2,1 2,4a ± 0,15 Cụm mơ sẹo to có dạng sợi màu trắng đến nâuvà xốp.
0,1 NAA 59,7bc ± 4,7 30,3c ± 4,7 1,6b ± 0,17 Cụm mô sẹo dạng sợi màu trắng đến nâu và chậm phát triển. 1,0 NAA 61,3bc ± 3,8 41,7bc ± 5,7 1,7b ± 0,10 Cụm mô sẹo dạng sợi màu trắng đến nâu và chậm phát triển. 0,1 BAP 58,3b ± 2,1 25,0c ± 5,6 1,7b ± 0,20 Cụm mô sẹo dạng sợi màu trắng đến nâu và chậm phát triển. 1,0 BAP 53,7c ± 2,1 50,3b ± 4,2 1,6b ± 0,10 Cụm mô sẹo dạng sợi màu trắng đến nâu và chậm phát triển. 0,1 NAA + 0,1 BAP 59,0bc ± 2,0 25,3c ± 5,0 1,5b± 0,15 Cụm mô sẹo dạng sợi màu trắng đến nâu và chậm phát triển. 1,0 NAA + 1,0 BAP 63,3b ± 1,5 61,3b ± 3,2 1,4b ± 0,15 Cụm mô sẹo dạng sợi màu trắng đến nâu.
0,1 NAA + 1,0 BAP 61,3bc ± 4,5 58,3b ± 1,5 1,6b ± 0,06 Cụm mô sẹo dạng sợi màu trắng đến nâu. 1,0 NAA + 0,1 BAP 57,7bc ± 2,1 25,0c ± 5,0 1,7b ± 0,15 Cụm mô sẹo chậm phát triển.
Tóm lại, bổ sung NAA và BAP vào mơi trường PES đã khơng kích thích cảm ứng mô sẹo ở tất cả các nồng độ được nghiên cứu. Vì vậy, mơi trường PES khơng bổ sung NAA và BAP được sử dụng ở các thí nghiệm cảm ứng mơ sẹo tiếp theo.
Bên cạnh đó, những đĩa petri mang mẫu cấy được đặt dưới các CĐAS khác nhau. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy ở CĐAS 5 µmol photons.m-2.s-1, mẫucó khả năng cảm ứng mô sẹo thể hiện ở tỉ lệ cảm ứng, tỉ lệ sống và kích thước mơ sẹo cao nhất so với các nghiệm thức cịn lại (Bảng 3.6 và Hình 3.7.).
Hình 3.7. Hình thái mơ sẹo của dịng rong nâu Sacol dưới các CĐAS khác nhau sau 8 tuần ni cấy. Thước 2mm
A: 5 µmol photons.m-2.s-1
B: 15 µmol photons.m-2.s-1
C: 35 µmol photons.m-2.s-1
D: 55 µmol photons.m-2.s-1
Sau 4 tuần nuôi cấy, mẫu không cảm ứng mô sẹo ở điều kiện tối. Ngược lại, ở CĐAS 5 µmol photons.m-2.s-1 mơ sẹo có tỉ lệcảm ứng cao nhất (67,0%), tiếp theo ở CĐAS 15 – 35 µmol photons.m-2.s-1 đạt (56,7%; 55,3%; tương ứng); cuối cùng ở CĐAS 55 µmol photons.m-2.s-1 có tỉ lệ cảm ứng mô sẹo (33,1%) thấp nhất (Bảng
3.6). Sau 8 tuần nuôi cấy, tỉ lệ sống mô sẹo 40 – 64,7% ở CĐAS 35 – 55 µmol
photons.m-2.s-1 thấp hơn so với CĐAS từ 5 – 15 µmol photons.m-2.s-1 (77,7 – 79,0%)
(Bảng 3.6). Sự phát triển của mô sẹo cũng không giống nhau dưới các CĐAS khác nhau. Mơ sẹo có cụm lớn (2,5 – 2,6 mm), dạng sợi, có màu hơi nâu được tìm thấy ở CĐAS thấp (5 – 15 µmol photons.m-2.s-1) (Hình 3.7. A, B), những cụm mơ sẹo này là nguồn nguyên liệu tốt cho các thí nghiệm tiếp theo. Ở CĐAS cao hơn, mô sẹo phát triển kém, mô cấy dưới CĐAS cao bị tẩy trắng sau 1 tuần nuôi cấy và dẫn đến mô cấy bị hoại tử và mơ sẹo hoại tử theo (Hình 3.7. D).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của CĐAS đối với cảm ứngmơ sẹo dịng rong nâu Sacol sau 8 tuần ni cấy, n = 30
Cường độ ánh sáng (µmol photons.m-2.s-1) Tỉ lệ cảm ứng (%) Tỉ lệ
sống (%) Kích thước mơ sẹo
(mm)
Mơ tả hình thái
0 Hoại tử Hoại tử Hoại tử Mẫu rong không cảm ứng
mô sẹo và bị hoại tử.
5 67,0a ± 4,6 77,7a ± 3,5 2,6a ± 0,10
Cụm mô sẹo dạng sợi
màu trắng hơi nâu, cụm mô sẹo to.
15 56,7b ± 3,3 79,0a ± 4,6 2,5a ± 0,15
Cụm mơ sẹo có kích thước lớn, dạng sợi màu trắng hơi nâu.
35 55,3b ± 1,5 64,7b ± 3,8 1,3b ± 0,20 Cụm mô sẹo nhỏ, dạng sợi màu trắng hơi nâu.
55 33,1c ± 4,0 40,0c ± 3,5 0,5c ± 0,15
Cụm mô sẹo dạng sợi màu trắng hơi nâu, sau 8 tuần cụm mô sẹo bị hoại tử. Ghi chú: Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê với phép thử Ducan (với p < 0,05).
Nhu cầu về CĐAS để mẫu cảm ứng mơ sẹo tùy thuộc vào lồi rong. Tuy nhiên, hầu hết các lồi có đặc điểm chung là đều cần ánh sáng ở cường độ thấp để mẫu cảm ứng mô sẹo và phát triển [48, 153]. Ở nghiên cứu này, tỉ lệ cảm ứng mô sẹo thấp hơn rất nhiều so với các báo cáo trước đây trên rong Sụn. Tỉ lệcảm ứng mô sẹo cao nhất
là 67% ở 5 µmol photons.m-2.s-1 thấp hơn so với kết quả trên rong Sụn là 96 – 98% ở
5 – 25 µmol photons.m-2.s-1 [157] và 80% ở 5 µmol photons.m-2.s-1 [48]. Tuy nhiên,
tỉ lệ cảm ứng mơ sẹo ở thí nghiệm này cao hơn so với loài Hypnea tenerrimum là
10% ở 5 – 30 µmol photons.m-2.s-1, lồi G. corticata (40%), Sargassum tenerrium
(10%) và Turbinaria conoides (40%) ở 30 µmol photons.m-2.s-1 [153].
Tỉ lệmẫu sống sau 8 tuầnnuôi cấy giảm đáng kể khi nuôi ở CĐAS cao, mẫu cấy mang mô sẹo bị tẩy trắng và hoại tử khi chưa thu được mô sẹo. Kết quả này tương tự với kết quả của Reddy và cộng sự [48], Vũ Thị Mơ và Reddy [157]. Ánh sáng không ảnh hưởng tới tỉ lệhình thành mơ sẹo của rong Sụn. Tuy nhiên, nếu mẫu rong tiếp tục được giữ ở CĐAS cao (70 µmol photons.m-2.s-1) trong thời gian dài thì chúng bị tẩy trắng. Ở điều kiện tối khơng ghi nhận được sự hình thành mơ sẹo ở rong Sụn
[48] và rong Grateloupia doryphora [82]. Các loài rong H. tenerrimum, G. corticata,
S. tenerrium và T. conoides cũng có tỉ lệ cảm ứng mô sẹo cao nhất ở CĐAS 5 – 30
µmol photons.m-2.s-1 [82].
Đối với nghiên cứu này, mẫu rong nuôi cấy dưới các CĐAS từ 5 – 55 µmol
photons.m-2.s-1 đều cảm ứng mơ sẹo và có tỉ lệ sống khác nhau. Theo kết quả nghiên
cứu cho thấy khi mô sẹo đã được cảm ứng ở các CĐAS khác nhau (5 – 55 µmol
photons.m-2.s-1) thì cần duy trì CĐAS từ 5 µmol photons.m-2.s-1 đến 15 µmol
photons.m-2.s-1 để tỉ lệ sống đạt cao nhất và mô sẹo phát triển tốt nhất. Kết quả cho
thấy CĐAS 5 µmol photons.m-2.s-1 có tỉ lệcảm ứng và tỉ lệsốngcũng như kích thước mơ sẹo cao nhất. Do đó, trong giai đoạn cảm ứng mơ sẹo, mẫu rong được đặt dưới CĐAS 5 µmol photons.m-2.s-1.
Cuối cùng, mẫu sạch VSV được cấy vào môi trường PES bổ sung các hàm lượng agar khác nhau và đặt dưới CĐAS 5 µmol photons.m-2.s-1. Sau 8 tuần ni cấy, kết quả mẫu cảm ứng mô sẹo tốt nhất ở môi trường PES bổ sung 15 g.L-1 agar (Bảng 3.7 và Hình 3.8.)
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của hàm lượng agar đối với cảm ứng mơ sẹo dịng rong nâu
Sacol sau 8 tuần nuôi cấy, n = 30
Hàm lượng agar (g.L-1 ) Tỉ lệ cảm ứng (%) Tỉ lệsống (%) Kích thước (mm) Mơ tả hình thái 5 50,3b ± 3,1 45,0c ± 2,0 2,1b ± 0,10