Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

CHƯƠNG 2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.6.1. Phương pháp xác định tính độc tếbào ung thư (cytotoxic assay)

*Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

Vật liệu và hoá chất

- FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma)

- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad)

-Chất tham khảo: Ellipticine -Các hóa chất thơng thường khác

-Các dòng tếbào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.

Phương pháp thửđộđộc tếbào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thửđộđộc tế bào chuẩn

nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tửprotein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thểnhư sau:

- Chất thửđược pha thành các dải nồng độ thích hợp

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm đểđiều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 200 g/ml; 40 g/ml; 8 g/ml và 1.6 g/ml. Ủ trong tủ ấm 48 giờ.

Giếng khơng có chất thử nhưng có TBUT (180l) sẽđược sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA.

- Sau 48 giờ, tếbào được cốđịnh bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khơ ở nhiệt độ phịng.

- 10 mM unbuffered Tris base đểhòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút. - Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).

- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽđược xác định thơng qua công thức sau:

[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 % ức chế = 100% -

OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)

- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở cá cnồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương;

- DMSO 10% được sử dụng là đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính tốt với IC50  20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50  5 mM. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.6.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme histone deacetylases (HDAC) trên dòng tế bào MCF7 (HDAC) trên dòng tế bào MCF7

- Tếbào ung thư vú của người MCF-7 được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) và nuôi trong tủấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. Thu tếbào và đưa tế bào ra đĩa thí nghiệm, đểqua đêm cho tế bào ổn định và đạt độ bám khoảng 80% bề mặt giếng.

- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Một giếng khác khơng có chất thử nhưng có tế bào và 10l DMSO sẽđược sử dụng làm đối chứng âm. Ủ mẫu trong 24h.

- Loại bỏ dịch nổi môi trường nuôi cấy, rửa tế bào bằng dung dịch PBS. Thu tế bào và sử dụng bộ KIT Nuclear/Cytosol Fractionnation của hãng Biovision để thu được nuclear extract (các bước tiến hành được thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất). Bảo quản mẫu ở - 80oC trước khi tiến hành các bước phân tích xác định hoạt tính HDAC.

- Việc xác định khả năng ức chế hoạt tính enzyme histone deacetylases được thực hiện dựa trên bộ KIT Colorimetric HDAC Activity assay (BioVision). Với các thành phần bao gồm: HDAC Substrate [Boc-Lys(Ac)-pNA, 10 mM], 10X HDAC Assay Buffer, Lysine Developer, HDAC Inhibitor (Trichostatin A, 1 mM), HeLa Nuclear Extract, Deacetylated Standard (Boc-Lys-pNA, 10 mM). Cụ thể là:

+ Pha MCF-7 nuclear extract đã được xử lí mẫu trong nước để đạt tới thể tích cuối cùng là 85l và 85l mẫu đối chứng âm có enzyme HDAC nuclear extract

của tế bào MCF-7 khơng được xử lí mẫu cũng được tiến hành song song để so sánh khảnăng ức chế HDAC của mẫu thử. Mẫu đối chứng trắng chỉ cho 85 l nước. Đối với các giếng đối chứng dương chuẩn của KIT pha 10l Hela nuclear extract với 75

l nước, với các giếng đối chứng âm chuẩn của KIT pha mẫu với 83 l nước và thêm 2 l SAHA (chất ức chế HDAC) được sử dụng như một giếng khơng có hoạt tính HDAC.

+ Thêm 10 l 10X HDAC Assay Buffer vào mỗi giếng.

+ Thêm 5 l HDAC Substrate vào các giếng và trộn kĩ. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h hoặc lâu hơn nếu cần thiết.

+ Dừng phản ứng bằng việc cho thêm 10 l Lysine Developer, trộn kĩ. Ủđĩa ở 37o

C trong 30 phút.

+ Đọc kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader ở bước sóng 400 - 405 nm.

+ Khả năng ức chế enzyme histon deacetylases (HDAC) được tính theo cơng thức:

OD (chất thử) *100 % ức chế hoạt tính HDAC = 100% -

OD (đối chứng âm)

Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym HDAC được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.