1.3.2.3 .Công thức phối trộn cơ chất
1.5. Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm Linhchi trên thế giới và ở Việt Nam
1.5.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm Linh chi trên thế giới
Nấm Linh chi có giá trị dược liệu và kinh tế cao nên được rất nhiều nhà khoa học của nhiều nước nghiên cứu.
Theo Wang X. J., từ năm 1621 nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở Trung
trồng đại trà thành công nấm Linh chi Ganoderma lucidium ở Đại học Nông nghiệp Tokyo, Nhật Bản. Từ đó cơng nghệ ni trồng Linh chi ở Nhật Bản phát triển
mạnh, sản lượng từ năm 1979 - 1995 đã tăng 40 lần [10], [11]. Nhật Bản là nước
đầu tiên trồng thành công nấm Linh chi và việc nghiên cứu khoa học và bào chế các sản phẩm dược liệu được sếp vào hàng đầu trên thế giới. Hàn Quốc cũng là một nước có cơng nghệ sản xuất nấm Linh chi rất phát triển.
Từ năm 1929, Linh chi cũng đã được nghiên cứu và nuôi trồng tại Ấn Độ nhưng chỉ phát triển ở quy mô nhỏ [22].
Ở Canada cũng nghiên cứu nuôi trồng nấm Linh chi nhằm đánh giá đặc tính
phá hủy xenlulose và vận dụng để định dạng nhóm lồi, đặc biệt là nhóm
Ganoderma lucidium [21].
Tại Đài Loan, Peng (1990) và Hseu (1992) đã sưu tầm, nuôi trồng thành
cơng hơn 10 lồi Ganoderma khác nhau [33]. Hàn Quốc cũng chiếm một thị phần
đáng kể và đặc biệt chú ý tới loài Cổ Linh chi với hiệu lực chống khối u cao. Song
Trung Quốc vẫn được thừa nhận là trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng và sản xuất nấm Linh chi (Zao et Zhang, 1994). Theo thống kê của Moore và Chiu (2000) thì tổng sản lượng Linh chi tồn cầu năm 1997 đạt khoảng 4300 tấn thì sản lượng của Trung Quốc đã là 3000 tấn.
Các nước Đông Nam Á gần đây cũng bắt đầu nghiên cứu về Linh chi. Malaysia chú trọng cải tiến các qui trình trồng Linh chi ngắn ngày trên các phế thải nơng nghiệp [34], [37], thậm chí cho thu quả thể sau 40- 45 ngày. Malaysia cũng đã
nghiên cứu ni trồng thành cơng lồi G. bobisense thường mọc trên cây cọ dầu.
Do có tính dược liệu cao mà nấm Linh chi đã được xác định là đối tượng trên
các thực nghiệm học và qui mô trồng công nghiêp ở Hoa Kỳ ( Allice Chen et al.,
1996) [24]. Việc thành lập viện nghiên cứu nấm Linh chi Quốc tế ở New York được cho là một bước tiến quan trọng , đánh dấu một giai đoan mới trong lĩnh vực nghiên cứu và nuôi trồng nấm Linh chi.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm Linh chi ở Việt Nam
Từ thập kỷ 70 trở lại đây, một số cơ quan, đơn vị chủ yếu ở Việt Nam đã bắt
đầu quan tâm đến nghiên cứu chọn tạo các giống nấm ăn và nấm dược liệu như:
- Trung tâm nghiên cứu nấm ăn - Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Viện Vi sinh vật và Côngnghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Khoa Sinh học - Đại học Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh.
- Cơng ty Dược liệu Trung ương II (TP. Hồ Chí Minh).
- Viên nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt.
- Trung tâm Công nghệ Sinh học Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp.
Vào năm 1978, loài G. lucidium mới bắt đầu được ni trồng thành cơng trong
phịng thí nghiệm. Từ năm 1990, nấm Linh chi mới bùng nổ ở thành phố Hồ Chí Minh, lượng nấm Linh chi hàng năm mới đạt khoảng 10 tấn [11], [19], [20]. Đến năm
1994, Phạm Quang Thu đã đưa nấm Lim - một chủng nấm Linh chi của vùng rừng
lim Bắc Bộ vào nuôi trồng chủ động [19]. Năm 1995 - 1996, Lê Xuân Thám ở Viên
nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt đã nuôi trồng thành công 11 chủng Linh chi thuộc 3 chi:
Ganoderma, Amayroderma và Humphreya [13], [14], [15], [16], [17].
Từ năm 1997 đến nay, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thực vật - Viện Di
truyền Nông nghiệp đã nghiên cứu và nuôi trồng thành công nhiều chủng nấm Linh chi khác nhau, mở rộng phong trào nuôi trồng Linh chi ở Hà Nội và các tỉnh phía Bắc.
Hiện nay, việc trồng các loại nấm ăn nói chung và nấm dược liệu nói riêng theo hướng sản xuất hàng hóa trong cơ chế thị trường cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đang thu hút được sự quan tâm của nhiều người, mà đặc biệt là nấm Linh chi - một loại nấm dược liệu quý.
Tuy nhiên, công tác phát triển nghề trồng nấm ở nước ta trong thời gian qua còn tồn tại một số vấn đề sau:
Công tác bảo tồn, lưu giữ nguồn gen nấm cần được đầu tư, học tập và trao đổi nhiều hơn để nâng cao trình độ, chống thối hóa giống.
Các cơ sở ni trồng nấm cịn nhỏ lẻ, phân tán. Quy mơ sản xuất cịn mang tính thời vụ, thủ cơng, chưa áp dụng cơ giới hóa vào sản xuất cơng nghiệp.
Khâu chế biến trình độ cịn thấp, chủ yếu là sơ chế và tiêu thụ sản phẩm tuơi.
Công tác nghiên cứu và các giải pháp về phòng trừ sâu bệnh trong sản xuất còn chưa được chú ý đúng mức để phát triển nấm bền vững.
Công việc nghiên cứu xử lý bã nấm thành nguồn phân bón hữu cơ chưa được đầu tư nhiều, cịn bỏ phí nguồn phân hữu cơ rất lớn cho ngành sản xuất nơng nghiệp.
Chính vì vậy, lượng nấm sản xuất ra ở nước ta hiện nay mới chỉ đáp ứng được một phần nhu cầu tiêu dùng của người dân trong nước. Các sản phẩm nấm được người tiêu dùng sử dụng hiện nay vẫn phải nhập khẩu từ các nước Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan… và vấn đề về chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm không được đảm bảo.
Nhưng hiện nay, dưới định hướng của Chính phủ, các Bộ, Ngành việc phát
triển sản xuất Nấm ăn - Nấm dược liệu đã được coi trọng. Trong chương trình phát
triển sản phẩm quốc giađến năm 2020, sản phẩm Nấm ăn - Nấm dược liệu đã được
CHƯƠNG 2.
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
- Khoai tây, agar, glucose, cao nấm men, pepton, KH2PO4...
- Thóc tẻ : Khơ, khơng bị mọt, cùng chủng giống, ít nhựa.
- Mùn cưa các loại gỗ khơng có tinh dầu, khơng nhiễm mốc, chưa bị xử lý
qua hoá chất.
- Bột ngô, cám gạo: Nghiền mịn, không mốc, mọt.
- Bột CaCO3.
2.1.2. Vật tư thiết bị, lán xưởng
- Máy nghiền, máy sàng nguyên liệu.
- Máy trộn, dụng cụ cân đo, đồ đựng các loại…
- Dụng cụ khác…
- Thiết bị khử trùng: nồi hơi, lị hấp thủ cơng, nồi BK75.
- Trang thiết bị cấy giống: Phòng cấy, box cấy, dụng cụ cấy… (Phải đảm bảo
vô trùng khi cấy giống).
- Phịng ni giống nấm: Cần đảm bảo sạch sẽ, khơ, thơng thống tốt, ánh sáng yếu, điều chỉnh được nhiệt độ.
- Lán trại nuôi trồng: Cần đảm bảo u cầu kỹ thuật, sạch sẽ, thơng thống
tốt, khống chế được nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng.
2.1.3. Nguồn giống
Gồm 3 chủng nấm linh chi ký hiệu là: DT, D12, D18. Giống nấm được thu thập từ tự nhiên của Việt Nam, hiện được lưu giữ tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thực vật.
- Chủng DT (Đối chứng): là giống Linh chi được dùng sản xuất đại trà tại
- Chủng D12: Là giống nấm Linh chi được thu thập tại Đông Triều – Quảng
Ninh.
- Chủng D18: Là giống nấm Linh chi được thu thập tại Quảng Nam.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường thuần
khiết.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi.
- Nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi, sự hình thành quả thể nấm Linh chi
trên giá thể nuôi trồng.
- Nghiên cứu kỹ thuật ni trồng nấm Linh chi.
- Phân tích một số thành phần hóa sinh cơ bản của quả thể nấm Linh chi.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp nấm học trong nghiên cứu hình thái quả thể, bào tử, hệ sợi và nghiên cứu tốc độ mọc của hệ sợi nấm (Trịnh Tam Kiệt, 1981, 1986)
[4], [7]. Sử dụng phương pháp nuôi trồng thực hiện theo “Công nghệ nuôi trồng nấm ăn và nấm dược liệu”[8].
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy đánh giá tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường thuần khiết. chi trên môi trường thuần khiết.
Bảng 2.1: Thành phần các mơi trường thuần khiết (g/lít)
Nguyên liệu Môi trường Khoai tây Bột ngô Cám
gạo Pepton KH2PO4 Glucose Agar
I (ĐC) 200 20 20
II 200 20 20 2 1 20 20
III 200 20 20 20 20
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch,cắt thành từng lát dày 1,5 - 2 cm, cho vào nồi, bổ
sung nước, đun sôi (10 - 15 phút) đến khi khoai nhừ nhưng không bị nát tung ra là
được, lọc lấy nước chiết.
Bột ngô và cám gạo hòa vào nước ấm (40 - 450C), lọc lấy nước trong.
Trộn 2 dịch chiết trên với nhau, bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Sau đó thêm
pepton, agar, các ngun tố khống; đun sơi đến khi agar tan hết, vớt sạch bọt, bổ sung glucose vào, khuấy khoảng 1 phút là được (thành phần các chất như bảng 2.1).
Môi trường trên được đổ vào bình tam giác 250ml, mỗi bình đổ 100ml, khử trùng ở
nhiệt độ 1210C (1atm) trong 55 phút. Sau khi khử trùng, để nguội cho đông thạch
rồi tiến hành cấy giống, theo dõi tốc độ mọc của sợi.
Mỗi bình cấy một miếng giống gốc có đường kính khoảng 4mm, ni ở
phịng có nhiệt độ 25 - 270C. Hàng ngày theo dõi tốc độ mọc của sợi, đặc điểm hệ
sợi của nấm Linh chi trong các cơng thức mơi trường trên. Mỗi thí nghiệm lặp lại 5 lần.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng của sợi nấm Linh chi trưởng của sợi nấm Linh chi
Thí nghiệm thu sinh khối của hệ sợi nấm Linh chi được nuôi cấy trong môi
trường lỏng. Sử dụng Cơng thức II để tiến hành thí nghiệm: 20g bột ngơ + 20g cám
gạo + 2g pepton + 1g KH2PO4 + 20g glucose + 1000ml nước cất.
Cách chuẩn bị môi trường giống như phần 2.3.1 không bổ sung thạch.
2.3.2.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi sợi nấm Linh chi
Đổ mơi trường vào bình tam giác thể tích 250 ml, mỗi bình đổ 100 ml
Điều chỉnh pH mơi trường ở các mức khác nhau từ 3-8 bằng dung dịch HCl
1M và NaOH 1M. Khử trùng ở nhiệt độ 1210C (1atm) trong 55 phút, kiểm tra lại
pH môi trường sau khi khử trùng. Để nguội môi trường rồi tiến hành cấy giống. Mỗi bình tam giác cấy 3 miếng giống gốc, mỗi miếng có đường kính khoảng
độ lắc 110 vịng/phút.
Kết thúc q trình ni sợi, ly tâm dung dịnh nuôi cấy để tách sợi nấm, sấy khô sợi nấm đến khối lượng không đổi. Khối lượng sợi khơ được tính bằng mg/100ml dịch ni.
2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng của nấm Linh chi. của nấm Linh chi.
Cấy vào mỗi bình tam giác (250 ml) chứa 100 ml môi trường lỏng đã được khử trùng 3 miếng giống gốc có đường kính khoảng 4 mm, đem giống ni trên máy lắc có tốc độ lắc 110 vòng/phút ở các nhiệt độ khác nhau: 200C, 250C, 300C, 350C. Thời gian nuôi sợi khoảng 7 ngày.
Kết thúc q trình ni sợi, ly tâm dung dịch ni cấy để tách sợi nấm, sấy khô sợi nấm đến khối lượng không đổi. Khối lượng sợi khô được tính bằng mg/100ml dịch ni.
2.3.3. Phương pháp đánh giá tốc độ sinh trưởng và đặc điểm hệ sợi trong môi trường nhân giống cấp 2. trường nhân giống cấp 2.
Giống cấp hai được nhân chuyển từ giống cấp một và được sử dụng làm giống ni trồng.
Mơi trường nhân giống cấp hai có thành phần chính là thóc luộc nứt vỏ, mùn
cưa đã qua xử lý có độẩm 65-68% và bổ sung một số phụ gia khác.
Bảng 2.2: Thành phần môi trường nhân giống cấp hai
(tỷ lệ % khối lượng)
Ngun liệu Cơng thức
Thóc luộc Mùn cưa Cám ngơ Cám gạo CaCO3
CT 1 CT 2 CT 3 99 69 30 79 10 10 1 1 1
Thóc: cần chọn thóc tẻ loại có chất lượng tốt, cùng chủng loại, kích thước hạt
đồng đều, nên chọn loại thóc có ít nhựa (khi luộc khơng bị nát). Thóc ngâm khoảng
12h, đãi sạch, loại bỏ thóc lép bằng cách gạn rửa nhiều lần, luộc đến nứt vỏ, đổ ra rổ làm nguội thật nhanh tránh làm nát thóc.
Mùn cưa ủ bằng nước vơi trong 1% (pH = 12), đạt độ ẩm 65-68% trong 24h.
Phối trộn nguyên liệu như bảng 2.2.
Các công thức sau khi phối trộn, đóng vào chai thủy tinh có kích thước
7x12cm. Khử trùng ở nhiệt độ 1210C (1atm) trong 90 phút, để nguội rồi cấy giống.
Nuôi sợi ở nhiệt độ 24-270C, phịng ni cần thơng thống, ít ánh sáng.
Các chỉ tiêu theo dõi:tỷ lệ nhiễm, tốc độ phát triển sợi, đặc điểm hệ sợi.
2.3.4. Phương pháp đánh giá sự sinh trưởng của hệ sợi và sự hình thành quả thể nấm Linh chi trên giá thể nuôi trồng. nấm Linh chi trên giá thể nuôi trồng.
Mùn cưa bồ đề hoặc mùn cưa các loại gỗ khơng có tinh dầu, khơng bị mốc, khơng dính dầu máy, được làm ẩm bằng nước vôi trong 1%, ủ trong 24h, độ ẩm nguyên liệu sau ủ đạt 65 - 67%. Tiến hành phối trộn mùn cưa đã xử lý với các
nguyên liệu bổ sung khác theo tỷ lệ: 83,5% mùn cưa + 7% bột ngô + 8% cám gạo +
0,5% đường sacharose + 1% CaCO3. Đây là công thức môi trường chuẩn đang được
áp dụng để sản xuất tại Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thực vật.
Tồn bộ cơ chất phối trộn được đóng vào bịch có kích thước 25x 35cm, khối
lượng khoảng 1,4 - 1,6kg, khử trùng bằng nồi autoclave ở 1,2 - 1,5 atm trong thời
gian 2,5 giờ. Để nguội rồi tiến hành cấy giống. Chuyển bịch vào trong phịng ni
cho đến khi sợi lan được 1/2 - 2/3 bịch nấm thì tiến hành nới nút bông cho nấm mọc
qua cổ nút rồi chuyển bịch vào nhà nuôi trồng.
Các chỉ tiêu theo dõi gồm: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi, nhiệt độ và thời
2.3.5. Phương pháp nuôi trồng nấm Linh chi
2.3.5.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn và phương pháp khử trùng đến tỷ lệ nhiễm bệnh đến tỷ lệ nhiễm bệnh
Mùn cưa bồ đề hoặc mùn cưa các loại gỗ khơng có tinh dầu, khơng bị mốc, khơng dính dầu máy, được làm ẩm bằng nước vôi trong 1%, ủ trong 24h, độ ẩm nguyên liệu sau ủ đạt 65 - 67%. Tiến hành phối trộn mùn cưa đã xử lý với các nguyên liệu bổ sung khác theo bảng 2.3.
Bảng 2.3: Thành phần môi trường cơ chất phối trộn (% khối lượng)
Thành phần
Công thức
Mùn cưa Bột ngô Cám gạo Saccarose CaCO3
I (ĐC) 83,5 8 7 0,5 1
II 88,5 5 5 0,5 1
III 81,5 9 9 0,5 1
IV 78,5 10 10 0,5 1
Toàn bộ nguyên liệu được phối trộn đồng đều, tiến hành đóng túi 25 x 35cm,
khối lượng 1,4 - 1,6 kg rồi đem khử trùng. Bịch được khử trùng bằng lị thủ cơng
trong 6h và khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở áp suất 1,2 - 1,5at/ 2,5h.
Sau khi khử trùng để nguội bịch, tiến hành cấy giống, chuyển bịch sang khu
vực ni sợi ở phịng có nhiệt độ từ 25 - 270C, phịng cần thơng thống và khơng
cần ánh sáng. Trong thời gian nuôi sợi phải thường xuyên kiểm tra loại bỏ bịch nhiễm.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nhiễm, nguyên nhân nhiễm.
2.3.5.2. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất nấm Linh chi. suất nấm Linh chi.
chủng cấy 150 bịch từ 3 - 5 lần lặp lại. Cấy xong chuyển sang khu vực ni sợi ở phịng có nhiệt độ từ 25 - 270C. Khi sợi lan được 1/2 - 2/3 bịch nới nút bông cho ra quả thể rồi chuyển sang khu vực chăm sóc, thu hái quả thể.
Các chỉ tiêu theo dõi: